生物制药工艺技术基础

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1、第二章生物制药工艺技术基础Basisofbiopharmaceuticaltechnology一、生物材料的选择：1．生物活性物质存在部位：胞内、胞外、胞浆、质膜、器膜、周质2．生物材料的采集与质控（1）品种鉴定；（2）防止污染与感染；（3）选择富集目的物材料；（4）冷冻保存第一节生物药物提取、分离、纯化技术基础二、生物活性物质物质常用的提取方法与优化（一）几种常用提取方法1．酸、碱、盐水溶液提取方法2．表面活性剂提取方法与反胶束提取方法3．有机溶剂提取4.双水相萃取法5．超临界萃取法（二）提取方法与优化1.溶剂选择2.选择添加剂①保护剂；②酶抑制剂3.提取条件①温度；②pH；

2、③盐；④表面活性剂三．浓缩与干燥1.浓缩方法：①盐析；②有机溶剂沉淀；③高分子脱水④超滤；⑤真空浓缩或薄膜浓缩；（书P45页）2.干燥：①低温真空干燥；②喷雾干燥；③冷冻干燥（书P47页）四、分离纯化1.生化制药工艺中分离纯化特点:(1)生物材料组成复杂(2)目的物含量低(3)易变性、失活(4)分离方法有很大经验成分(5)步骤多，逐级分离(6)产品验证与化学上纯度概念不完全相同(书P49页)2.分离纯化原理P49页(1)根据分子形状与分子大小(2)根据电荷差异(3)根据分子极性与溶解度大小(4)根据吸附特性(5)根据生物配基特性3.选择原则（1）粗品分离：大处理量,相对低分辨率盐

3、析，分级沉淀，萃取，超滤（2）精制：高分辨率多种色谱层析法,亲和层析，HPLC，FPLC，电泳或等电聚焦第二节微生物制药工艺技术基础一、菌种的选育与保藏1．自然选育依据自发突变原理，通过不断分离筛选，除去衰变菌落，选择高产菌，达到强化、复壮、稳定生产目的。方法：（1）平板划线法（2）稀释平板法2．诱变育种（1）出发菌株的选择①:稳定性;②:具备某种优良性状的菌株③:对诱变剂敏感;④:生理状态及生长时间（2）诱变处理:①化学诱变；②物理诱变;③生物诱变（3）筛选：①随机筛选；②半理性化筛选突变株筛选一般进程如图所示第三第四轮同第二轮第三第四轮同第二轮3、现代菌种选育技术①：杂交育种

4、②：原生质体融合③：基因工程技术(P55页)3．菌种保存（1）保存目的：防止退化（2）菌种退化检查方法（3）菌种退化防止方法①防止基因突变：如低温保藏②采用双重缺陷型③制作平行的菌种斜面，少传代④分离单菌落，自然筛选⑤选择培养条件（4）菌种保藏方法：①斜面低温保存②液体石蜡封藏法③甘油冷冻法④冷冻干燥法⑤液氮保藏法二、发酵工程技术基础发酵工程：单细胞纯培养工业化过程，以产生大量目的物。1．液体培养——深层发酵2．固体培养——浅盘培养发酵设备：空压机、种子罐、发酵罐，蒸汽发生器、空气过滤器、离心机及多种参数控制与检测设备，以L-Lys生产设备为例，见图1所示。图1L-Lys生产过程

5、工艺设备图第三节生物技术药物制造技术基础一、重组DNA技术原理1．基因工程操作过程：（1）获得目的基因；（2）构建DNA重组体；（3）将重组体导入宿主细胞；（4）工程菌的克隆与鉴定；（5）目的基因扩增与蛋白表达。2．基因工程药物制造过程二、基因工程主要操作技术1．目的基因的获得（1）cDNA文库纯化目的mRNA，逆转录成cDNA①mRNA的分离②cDNA第一链的合成③cDNA第二链的合成④cDNA与载体连接⑤转染或转化⑥筛选目的克隆目的基因的获得：cDNA文库（2）PCR法或逆转录PCR（RT-PCR）典型PCR反应包括①模板变性94℃以上（1～2′）②退火50～55℃（1～2

6、′）③延伸72℃（1～2′）在高温聚合酶作用下，以DNA单链为模板，由引物起始从5′→3′延伸。（3）化学合成法在已知DNA序列或多肽的一般结构时，如链长在60bp～100bp可用化学合成法直接合成DNA。2．DNA重组体的构建根据宿主菌不同，选择基因载体（Vector）（1）E.coli质粒非表达型pBR322，表达型pUC，实用型pBV220，PET系统，λ噬菌体DNA作为载体，非表达型λgt10，表达型λgt11。（2）芽孢杆菌pUB110pE194和pC194（3）链霉菌pIJ101pSG5cDNA与载体连接方法①同聚尾连接法②人工接头连接法3．重组体的表达系统（1）原核

7、表达系统①E.coli；②芽孢杆菌Bacillus；③链霉菌Streptomyces优点：易大量生产，成本低，周期短缺点：多为胞内表达、提取困难，易生成包含体、含起始密码Met(AUG)，有内毒素毒性（2）真核表达系统①酵母表达毕赤酵母（pichiapsatoris）受甲醇诱导优点：易培养无毒性，易高密度发酵（100g/L），高表达，成本低，产物可糖基化，有分泌表达。②动物细胞哺乳动物细胞——CHO（仓鼠细胞）昆虫细胞——家蚕细胞4．表达产物的纯化包含体inclusionbodi