基因的克隆与分离(I)

《基因的克隆与分离(I)》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第三章基因的克隆与分离目录基因工程概论1基因工程的工具酶和载体2基因的克隆和分离3基因的转移与重组体的筛选和鉴定4克隆基因的表达5植物基因工程6www.themegallery.comCompanyname结构基因的组成转录启动区核糖体识别区编码区转录终止区起始密码ATG开放读码框终止码TAG、TAA、TGA目的基因的定义准备要分离、改造、扩增或表达的基因。www.themegallery.comCompanyname第四章目的基因获取1.直接分离法2.构建基因组文库分离法3.PCR分离法4.化学合

2、成法www.themegallery.comCompanyname第一节直接分离法231限制性内切酶法随机片断化物理化学法www.themegallery.comCompanyname用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。酶切1.限制性内切酶法www.themegallery.comCompanyname适合于从简单的基因组中分离目的基因,如质粒或病毒的大小只有几千碱基,大的也超不过几十万碱基,编码基因比较少,获得也比较简单.应用对象1、对已知序列的DNA分子，只需要用已知识别序列的限制性

3、内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需要的DNA片断，与适当载体连接。2、对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的酶切识别位点，一次就可以获得。3、即使含目的基因的DNA分子未定序或定位，也只须通过酶切分析，随后再通过部分酶切，构建一个简单的基因文库，从钩出目的基因。www.themegallery.comCompanyname由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene优点缺点www.theme

4、gallery.comCompanyname控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。影响所切出的产物的长度和随机程度。2、随机片断化2.1限制性内切酶局部消化法限制性内切酶的选用原则①内切酶识别位点的碱基数②内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。www.themegallery.comCompanyname（1）超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。（2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。2.2机械切割法www.

5、themegallery.comCompanyname基本原理：DNA分子的两条链存在着G≡C、A＝T碱基配对，其中GC间存在3个氢键、AT间存在2个氢键，如果不同基因片段的碱基组成差异较大，其理化性质，如浮力密度和解链温度等也明显不同，采用相应的方法即可达到从生物基因组中分离目的基因的目的。密度梯度离心法非洲爪瞻5SDNA单链酶解法根据其热稳定海胆DNA3物理化学法www.themegallery.comCompanyname第四章目的基因获取1.直接分离法2.构建基因组文库分离法3.PCR分离法

6、4.化学合成法www.themegallery.comCompanyname将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。第二节构建基因组文库分离法1.基因文库（genelibrary）www.themegallery.comCompanyname一、基因文库某一生物部分基因的集合叫该生物的亚基因组文库。某一生物全部基因的集合叫该生物的基因文库。www.them

7、egallery.comCompanyname①载体的制备；②高纯度大分子量基因组DNA（HighmolecularweightDNA,HMWDNA）的提取；③HMWDNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离；④载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；⑤重组克隆的挑取和保存。基因组DNA文库的构建程序包含5个部分：www.themegallery.comCompanyname断点完全随机，片断长度合适于载体连接。超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。①物理切割法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到1

8、0-30kb的随机片断。②酶切法：2.基因文库构建的一般步骤（1）染色体DNA片段的制备www.themegallery.comCompanyname（2）目前常用的载体载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。（1）对载体的要求载体系列：容量为约20kpcosmid载体：容量为45kbYAC：容量为230kb-1700kbBAC:容量为300kb（2）载体与基因组DNA