聚合酶链反应(PCR)技术及其应用ppt课件.ppt

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1、PCR技术及其应用目录PCR技术简史PCR的原理PCR的反应体系和方法PCR的类型和应用PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚

2、合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖KaryB.Mullis<>1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸

3、年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。生物样品DNA片段基因诊断基因治疗基因工程产品法医学检测人类学研究……基因组DNA获取特定DNA片段扩增特定DNA片段引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段94℃55℃37℃TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)4050607080901001008060402072℃94℃55℃PCR循环PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物　　

4、　　　各10～100pmol模板DNA　　　0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/LPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR

5、的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理P

6、CR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从

7、100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA引物设计：（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。3’5’3’5’限制性内切酶的识别

8、序列启动子序列定点突变探针标记1）PCR反应成分（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应条件（2）引物浓度0.1-0.5mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）TaqDNA聚合酶（thermusaq