实验七亲和层析纯化和sds-page鉴定目的蛋白质(gst、sds-page)

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1、实验七亲和层析纯化和SDS-PAGE鉴定目的蛋白质实验目的掌握GST亲和层析纯化目的蛋白的原理和实验方法（第一部分）掌握SDS-PAGE检测目的蛋白原理和方法（第二部分）第一部分GST亲和层析纯化目的蛋白亲和层析原理生物大分子与配体特异非共价结合。酶-底物或底物类似物（竞争性抑制剂）抗体-抗原激素-受体外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体核酸-互补序列（Oligo-dT）亲和层析原理GSH-Sepharose4BGSH-Sepharose4BGSH-Sepharose4B亲和层析流程第一部分实验步

2、骤一、细胞破碎3600mL诱导的菌液，离心分装到12只50mL离心管，-20℃保存；（每个班用2管）每管加30mLPBS缓冲液，混匀；超声3S，暂停5S，持续15min；4℃，10000rpm，离心10min；取50uL上清，作为纯化前的样品；每组取3-5mL上清液，上柱纯化。二、装GSH-Sepharose4B柱1.清洗和装好层析柱，封闭出口；2.加入2mLPBS；3.取1-2mLGSH-Sepharose4B，加入柱子中；4.打开柱子出口，使PBS缓慢流出。注意：始终保持柱内的液面高于GSH-Se

3、pharose4B三、纯化目的蛋白1.用5mLPBS缓冲液洗柱子，重复3遍。2.将混合蛋白质溶液2-3mL加到柱子中。3.用5mLPBS缓冲液洗柱子，重复3遍。4.加入1.0mL洗脱液。5.用1.5mL离心管收集洗脱液，每管收集0.2mL（3-4滴），共收集5管。6.用5mLPBS缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。7.SDS-PAGE检测第2和3管中的目的蛋白。四、SDS-PAGE样品制备1号：过柱前的蛋白溶液80uL2号：收集的蛋白溶液（2号管）80uL3号：收集的蛋白溶液（3号管）80uL1-3号分别加

4、入20uL5×上样缓冲液，混匀后在沸水中加热3min。123M123M样品加30uLMarker加10uL亲和层析试剂PBS（pH7.4）:NaCl（58.5）40g；KCl（74.5）1.0g；KH2PO4（136.09）1.2g；Na2HPO4·12H2O（358.14）18.1g；加水定容到5000mL。亲和层析试剂50mMTris-HCl（pH8.0）:Tris（121.14）6.055g，溶于900mL水，用HCl调pH到8.0，用水定容至1000mL。洗脱液:还原型谷胱甘肽（307.32）

5、0.15366g，溶于50mL50mMTris-HCl（pH8.0）中。第二部分SDS-PAGE检测目的蛋白质实验目的掌握SDS-PAGE检测蛋白原理和方法掌握垂直板电泳的实验方法蛋白质与SDS按1:1.4比例形成复合物，消除了各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。在15-200KD之间，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系：logMW=K-bm实验原理连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同。（电荷效应、分子筛效应）不连续系统：缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电

6、位梯度的不连续性。（电荷效应、分子筛效应、浓缩效应）1.凝胶孔径的不连续性（2种孔径）2.缓冲液离子成分及pH值的不连续性（2种缓冲体系，3种pH）：浓缩胶，pH6.8，蛋白质分子的迁移率比Cl-低，比Gly高。浓缩效应3.电位梯度不连续性：快离子（Cl-）后面形成高电位梯度区，慢离子（Gly）前面形成低电位梯度区，高电位梯度和低电位梯度之间的地方，形成一个稳定而不断向阳极移动的界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭小的中间层。浓缩效应实验步骤1.洗净玻璃板，吹干，安装制胶器；2.制作12%分离胶。按下

7、表顺序加试剂，混匀，加入玻璃板间，加液高度与电泳槽中的横杠上沿等高；3.用1mL蒸馏水封住液面，室温30min，分离胶与水之间出现分界线，倒掉水层，用滤纸吸干残余的水；4.配制5%浓缩胶，混匀，加入玻璃板间，插入梳子，静置30min；12%分离胶试剂名称加液量ddH2O2.5mL30%Acr-Bis（29:1）3.0mL1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）2.0mL10%SDS75uLTEMED（加速剂）10uL10%AP（催化剂，最后加）75uL总体积7.5mL试剂名称加液量ddH2O3.

8、4mL30%Acr-Bis（29:1）0.86mL1.5mol/LTris-HCl（pH6.8）0.62mL10%SDS50uLTEMED20uL10%AP（最后加）50uL总体积5.0mL5%浓缩胶5.将胶板放入电泳槽，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液，轻轻拔掉梳子；6.点样：每个样点30uL，Marker点15uL；7.电泳：100V，约20min，样品进入分离胶后，将电压调到130V，继续电泳。溴酚蓝接近胶底部时，停止电泳；实验步骤8.拆开玻璃板