GBT19438.1-2004 禽流感病毒通用荧光 RT-PCR 检测方法.pdf

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1、ICS11.220一一B‘’看EJ中华人民共和国国家标准GB/T19438.1-2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法Methodofthereal-timeRT-PCRforthedetectionofavianinfluenzaviruswww.bzfxw.com2004-02-14发布2004-02-15实施+fPA豁aa瓣k&0&9A发“GB/T19438.1-2004前言GB/T19438-2004((禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分：—GB/T19438.1-2004((禽流感病毒通用荧光

2、RT-PCR检测方法》；—GB/T19438.2-2004((H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法））；—GB/T19438.3-2004((H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》；—GB/T19438.4-2004((H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》。本部分的附录A、附录C是规范性附录，附录B是资料性附录。本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本部分起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。本部分主要起草人：赖平安、张鹤晓、谷强、王甲正、周琦、杨伟、赖少

3、梅。www.bzfxw.comGB/T19438.1-2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法1范围本部分规定了禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测的操作方法。本部分适用于活禽及其产品中禽流感病毒的检测。2缩略语下列缩略语适用于本部分。2.1荧光RT-PCR荧光反转录一聚合酶链反应。2.2Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的闭值时所经历的循环数。2.3RNA核糖核酸。2.4DEPC焦碳酸乙二醋。2.5PBS磷酸盐缓冲盐水（配方见附录A).2.6Taq酶TaqDNA聚合酶。3原理禽流感病毒各亚型均属A型流感病毒，根据A型流感

4、病毒共有基因特定的序列，合成一对特异性引物和一条特www.bzfxw.com异性的荧光双标记探针。该探针与禽流感病毒特有的共同基因特异性结合，结合部位位于引物结合区域内。探针的5‘端和3‘端分别标记不同的荧光素，如5‘端标记FAM荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团（用R表示）,3’端一般标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5’端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团（用Q表示）。当PCR反应在退火阶段时，一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检

5、测不到R所发出的荧光信号；当PCR反应进行到延伸阶段时，Taq酶在引物的引导下，以四种核昔酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链；当链的延伸进行到探针结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，此时的Taq酶发挥它的5'-3‘外切核酸酶的功能，将探针水解成单核昔酸，消除阻碍，与此同时标记在探针上的R基团游离出来，R所发出的荧光再GB/T19438.1-2004不为Q所吸收而被检测仪所接收；在Taq酶的作用下继续延伸过程合成完整的新链，R和`2基团均游离于溶液中，仪器可继续检测到R所发出的荧光信号。4材料与试剂4.1仪器与器材

6、4.1.1荧光RT-PCR检测仪。4.1.2高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）。4.1.3台式离心机（离心速度3000r/min),4.1.4混匀器。4.1.5冰箱（20C^-8℃和一20℃两种）。4.1.6微量可调移液器（10uL,100川=1000IL)及配套带滤芯吸头。4.1．7Eppendorf管（1.5mL)。4.2试剂除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC水处理后高压灭菌）分装。4.2.1三氯甲烷。4.2.2异丙醇：一20℃预冷。4.2.3PBS:1

7、21℃士2'C,15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加入青霉素、链霉素各10000IU/mL.4.2.475％乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，-20℃预冷。4.2.5禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测试剂盒”：组成、功能及使用注意事项参见附录B,5抽样5.1采样工具下列采样工具必须经121℃士20C,15min高压灭菌并烘干：—棉拭子；—剪刀、镊子；—注射器；—l.5mLEppendorf管；—研钵。5.2样品采集5.2.1活禽取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：—取咽喉拭子时将拭子深人喉头口及上额裂来回刮3次～5次

8、取咽喉分泌液；—取泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔转一圈并沾取少量粪便；—将拭www.bzfxw.com子一并放人盛有1.0mLPBS的1.5mLEppendorf管中，加盖、编号。5.2.2肌肉或组织脏器待检样品装人一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。5.