GBT19438.1-2004 禽流感病毒通用荧光RT－PCR检测方法.pdf

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1、GB/T19438.1-2004月U吕GB/T19438-2004((禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分:—GB/T19438.1-2004((禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》;—GB/T19438.2-2004((H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》;—GB/T19438.3-2004((H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》;—GB/T19438.4-2004((H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》。本部分的附录A、附录C是规范性附录，附录B是资料性附录本部分由中华人民共和

2、国国家质量监督检验检疫总局提出。本部分起草单位:中华人民共和国北京出人境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。本部分主要起草人:赖平安、张鹤晓、谷强、王甲正、周琦、杨伟、赖少梅。.www.bzxzk.com.GB/T19438.1-2004毒通用荧光禽流感病检测方法RT-PCR范围本部分规定了禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测的操作方法本部分适用于活禽及其产品中禽流感病毒的检测。2缩略语下列缩略语适用于本部分。荧光RT-PCR荧光反转录一聚合酶链反应2.2Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的闽值时所经历的循环数2.3

3、RNA核糖核酸。2.4DEPC焦碳酸乙二酉旨2.5PBS磷酸盐缓冲盐水(配方见附录A)2.6Taq酶TaqDNA聚合酶。3原理禽流感病毒各亚型均属A型流感病毒，根据A型流感病毒共有基因特定的序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。该探针与禽流感病毒特有的共同基因特异性结合，结合部位位于引物结合区域内。探针的5’端和3‘端分别标记不同的荧光素，如5’端标记FAM荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团(用R表示),3’端一般标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5'端报告荧光基团发出的荧光信号，

4、称为淬灭荧光基团(用Q表示)。当PCR反应在退火阶段时，一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合，此时探针一上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号;当PCR反应进行到延伸阶段时，Taq酶在引物的引导下，以四种核昔酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链;当链的延伸进行到探针结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，此时的Taq酶发挥它的5'-3‘外切核酸酶的功能，将探针水解成单核昔酸，消除阻碍，与此同时标记在探针上的R基团游离出来，R所发出的荧光再.www.bzxzk.com.GB/T194

5、38.1-2004不为Q所吸收而被检测仪所接收;在Taq酶的作用下继续延伸过程合成完整的新链,R和Q基团均游离于溶液中，仪器可继续检测到R所发出的荧光信号。4材料与试荆4.1仪器与器材4.1.1荧光RT-PCR检测仪4.1.2高速台式冷冻离心机(离心速度12000r/min以上)。4.1.3台式离心机(离心速度3000r/min).4.1.4混匀器4.1.5冰箱(2℃一8℃和一20℃两种)4.1.6微量可调移液器(10pL,100川-,1000川_)及配套带滤芯吸头。4.1.7Eppendorf管(1.5ml)4.2试剂除特

6、别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器(用DEPC水处理后高压灭菌)分装。4.2.1三氯甲烷。4.2.2异丙醇:一20℃预冷4.2.3PBS:121℃士20C,15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加人青霉素、链霉素各10000IU/mL4.2.475%乙醇:用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，-20℃预冷。4.2.5禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测试剂盒l:组成、功能及使用注意事项参见附录Bo5抽样5.1采样工具下列采样工具必须经121℃士20C,15min高压灭菌并烘干:—棉拭子;—剪刀、

7、镊子;—注射器;-1.5ml.Eppendorf管;—研钵5.2样品采集5.2.1活禽取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下:—取咽喉拭子时将拭子深人喉头口及上颗裂来回刮3次一5次取咽喉分泌液;—取泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔转一圈并沾取少量粪便;—将拭子一并放人盛有1.0ml,PBS的1.5ml.Eppendorf管中，加盖、编号。5.2.2肌肉或组织脏器待检样品装人一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。5.2.3血清、血浆用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。5.3样品贮运样品采集后，放人密闭的

8、塑料袋内(一个采样点的样品，放一个塑料袋)，于保温箱中加冰、密封，送1)由指定单位提供.给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。.www.bzxzk.com.GB/T19438.1-2004实验室。5.4样品制备5