PCR技术在微生物鉴定中的应用

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1、昆虫分子生物学课程论文学院:植物保护学院课程:昆虫分子生物学学号:姓名:任课教师:职称:教授成绩:2015年8月29日-5-PCR技术在微生物鉴定中的应用摘要随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，特别是在微生物检测中的应用。细菌16SrDNA测序鉴定需进行DNA扩增、测序和分析，其设备条件和实验成本比传统的表型鉴定更高，从鉴定的准确率来看，其具有的优势毋庸置疑。同时，随着微生物检测技术的不断发展,BOX-PCR技术在微生物的多样性研究中也已得到应用。使用真菌ITS区域序列通用引物PCR扩增和DNA序列测定的方法，简便

2、快速、成本低稳定性好、结果可靠，适合实验室常规使用，可用于常见的和疑难真菌菌种快速鉴定。关键词PCR；16SrDNA；BOX-PCR；ITS；细菌；真菌PCR(polymerasechainreaction,PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成扩增特定DNA片段的方法，1985年美国Karray等学者首创了PCR技术并由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖、环境科学、食品安全等领域，包括基因的克隆、修饰、改建、构建cDNA文库、遗传病传染病的

3、诊断、法医学鉴定、物种起源、生物进化分析、流行病学调查等。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2-3]。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR（mutiplex，PCR）技术[4]、实时荧光定量PCR（real-timefluorescentquantitativePCR,FQ-PCR）技术[5]、单分子PCR技术[6]等。1PCR技术原理PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列，人工合成与该DNA2条链末端互补的2段寡核苷酸，引物在体外将待检

4、DNA序列模板在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94℃的条件下变性解链；第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55℃退火；第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’~3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后合成了新链可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中扩增产物的量，以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，D

5、NA可扩增l00万~200万倍[1]。2PCR技术在细菌鉴定中的应用细菌检测包括传统的形态学检查、分离培养、生化鉴定、免疫分析等多种方法，其中-5-细菌的分离培养最为关键，但对苛养菌及生长缓慢的细菌分离培养很棘手。近年来各种基因诊断技术在细菌检测中不断开发利用，尤其是基于聚合酶链反应（PCR）的基因诊断技术发挥着越来越重要的作用。2.116SrDNA在细菌鉴定中的应用16SrDNA是编码原核生物16SrRNA的基因,长度约1500bp,存在于所有细菌、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体和放线菌等原核生物的基因组中，由多个保守区（conserve

6、dregion）和与之相间的多个可变区(variableregion)组成保守区，为所有细菌共有，细菌之间无显著差异[8]；可变区在不同细菌之间存在一定的差异，具有细菌属或种特异性。PCR扩增16SrDNA包含两层含义:在保守区设计PCR通用引物，理论上可将存在于待测标本中的各种细菌都扩增出来；若选择可变区设计PCR特异性引物，则可将标本中的细菌鉴定到属种乃至菌株水平，因此16SrDNA已成为细菌鉴别与分类研究中较理想的靶序列[9]。细菌16SrDNA中含有９个可变区，命名为V1-V9区，确定某个可变区内具有细菌种特异性的序列就可能获得细菌实

7、验室诊断的有用靶点，除V2、V3、V4区稍长外，其他各高变区序列都很短，没有哪个高变区能区分所有细菌[10]。目前，已有很多基于16SrDNA全长或部分序列的应用研究：王永智等在对20余种致病菌进行16SrDNA多序列比对的基础上，设计扩增细菌16SrDNA的荧光定量PCR通用引物，检测血液细菌污染模拟标本[11]；应燕玲等通过13种标准菌株建立了一种基于16SrDNA全长特异性扩增和测序的方法，利用与GeneBank数据库比对，成功鉴定出血制品污染的11种未知细菌[12]；美国Maastricht大学医学中心研究的实时定量16SrDNAPC

8、R扩增系统，利用通用探针外加种或属特异性探针的多探针法，能在2h内对血液感染中常见的几种细菌，包括革兰阴性的假单胞菌、大肠埃希菌及革兰阳性的葡萄球菌、肠球菌、链球菌