如何提高PCR产物克隆的效率

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1、如何提高PCR产物克隆的效率作者：佚名    实验频道来源：生物通    点击数：    更新时间：2004-6-12把PCR产物克隆到载体上常见有3种做法：1.直接克隆到T载体（或者U载体上）2.引物设计时引入酶切位点，PCR产物酶切后直接克隆到目标载体上3.将平末端PCR产物直接克隆到平末端酶切载体上。   方法3主要是针对高保真的聚合酶比如Stratagene公司的Pfu酶，NewEnglandBiolabs公司的Vent酶，以及QIAGEN公司新出的同时具有热启动功能的高保真ProofStart酶，进行PCR扩增，由于这类酶有很强的校读功能，能

2、够以模版为准切掉错配的碱基，因而得到的PCR产物多数是平末端，不能用T载体克隆。通常需用目的载体多克隆位点上的平末端单酶切位点，单酶切得到平末端的线性片断，直接连接PCR产物。这类酶得到的产物通常不能用TA克隆试剂盒。目前也有商业化的平末端PCR产物克隆试剂盒，不过较少用。平末端的连接效率低，通常需要高浓度的连接酶，较长的连接时间，合适的片断：载体比例，有的时候还需要调整反应体系的ATP浓度或者增加聚乙二醇（PEG2000），以得到较高的连接效率。许多厂家都有推出快速连接试剂盒，比如NewEnglandBiolabs新出的5分钟快速连接试剂盒，能够简化

3、平端连接步骤和条件，缩短连接时间，提高连接效率。   不过需要注意的是一些厂家（例如Clontech、Gibco/BRL、Roche）也生产一些用于PCR的高保真混合酶，是采用常规Taq酶和一些有校读功能的（proofreading）的聚合酶按比例混合（这样得到的混合酶的保真性比普通Taq酶高一点，但通常不如Pfu、ProofStart等酶），因而得到的PCR产物也是平端和A末端的混合产物，是否能用TA克隆试剂盒需要参考厂家的说明。   方法2是比较常用的经济的方法，不需要购买T载体，可以直接通过酶切PCR产物，得到粘末端，直接连接到目的载体上。在顺的

4、时候，这种方法是非常简单的。可有时候也会出问题，双酶切就是连不上，比较常见的原因是PCR产物双酶切不完全，比如没有纯化产物就直接双酶切，有的酶比较“娇气”容易出现“切不动”或者是“星号活力”，得不到正常的粘末端而连不上。有时是因为选定的两种酶反应条件相差比较大，为了省事同时双酶切（通用Buffer不是一定通用的，不能过分迷信，有时会成为莫名其妙出错的根源），也会出现类似的错误。还有一种情况是由于有些酶在酶切时需要一定的“占位空间”，也就是要求酶切识别序列的前后有一定数量的碱基才能正常酶切，而设计引物时酶切位点直接就在5'末端，没有留下足够的保护碱基而导

5、致PCR产物酶切不动，无法正常的克隆。由于这些错误很难检查，有的时候会浪费大量的时间，还是莫名其妙没有结果。   由于常见的Taq酶或者没有校读功能的DNA聚合酶（即不是高保真）在PCR扩增的时候通常会在PCR产物末端多添加一个A（即增加一个模版上不存在的A）。这个突出的A成为PCR产物TA克隆技术的基础。带有互补的突出T末端的线性载体能够有效提高PCR产物的克隆效率，解决方法2遇到的难题，所以方法1也是目前比较常见的方法。   TA克隆在顺的时候也很简单，简直就是“apieceofcake”，不用考虑酶切位点，引物设计等等问题，好的载体克隆效率高、重

6、组率高而且两端有丰富的单酶切位点便于后继的克隆，但是烦的时候也会出现无缘无故克隆不上或者重组率很低的问题。比较容易忽略的问题是用高保真的酶进行PCR扩增，应该选用平端克隆载体而错用了TA载体。常见但很难解决的问题则是由于T末端容易和其他碱基错配而导致自身环化或者克隆了引物/自身褪火引物二聚体或者PCR不完整产物，因而出现假阳性。因而QIAGEN公司推出了UA克隆试剂盒，用突出的U末端代替T末端，由于U碱基能够有效减低和其他碱基（T、C、G）非特异退火的几率，因而能有效提高PCR产物的克隆效率。   但是，是否还有其他因素会影响PCR产物的克隆效率呢？最

7、近，QIAGEN公司的研发专家发现，PCR引物5'端的碱基（也就是引物第一个碱基）的不同，会影响PCR产物的克隆效率！以后设计引物可要注意了！看看QIAGEN的专家怎么说——RalfPeist,DorotheeHosel,TheaTutjes,andDirkLoffert   基于UA的克隆技术广泛应用于PCR产物的快速、简便和高效的克隆。由TaqDNA聚合酶为PCR产物添加的多出来的一个A碱基能够和pDriveCloningVector（QIAGENPCRCLoningKit提供）载体上的互补的U碱基配对结合。PCR产物能够高效地结合到载体上，无需在

8、引物中引入限制性内切酶位点，无需酶切或者平端连接。   在某些特殊情况下，由于一些未知的原因，