PCR产物克隆步骤以及注意事项.doc

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1、基因的克隆测序步骤以及注意事项一、DNA目的片段的扩增反应体系：cDNA（gDNA）2.0μL10×Buffer2.0μLMg2+1.6μLdNTPs1.2μL引物F0.6μL引物R0.6μLTaqpolymerase0.3μLddH2O11.7μLTotal20μL加适量石蜡油，扩增反应在PTC-220TetradThermalCycler(MJResearch)上进行。PCR反应程序：94℃3min94℃30s55℃*40s33cycles72℃1kb/1min72℃10min4℃保存*：PCR退火温度由引物序列（GC含量）决定。二、琼脂糖凝胶电泳检测（1）1g的琼脂糖

2、倒入装有100mLNEB的三角瓶中。（一般0.2g琼脂糖加20ml水可以倒1/4面平板）（2）微波炉加热至澄清无气泡，稍微冷却加1-2滴EB染色液（）（3）将胶倒入装置好的电泳托盘中，冷凝后放入电泳槽。（4）点样，90V-120V，20min左右。（5）电泳结束后置于凝胶成像仪下观察拍照。三、片段的回收（1）在紫外灯下切下含目的DNA的琼脂糖胶块，放入1.5mL的管中。（2）按每100mg琼脂糖加入300μLDE-A液（溶胶液）的比例加DE-A液，置75℃6~8min，每2min颠倒一次离心管，直至胶块完全溶化（当目的片段小于400bp时，加入1/3DE-A体积异丙醇。当目

3、的片段大于400bp时，可省略此步骤）。（3）加入1/2DE-A体积的DE-B溶液，混合后转入吸附柱，12000g离心30s，倒去下管中的液体。（4）在吸附柱中加入500μLW1液（洗涤液），12000g离心30s，倒去下管的液体。（5）再在吸附柱中加入700μLW2液，静置1min，12000g离心30s，倒去下管中的液体。重复一次。（6）12000g离心1min。（7）将吸附柱取出放入一个干净的1.5mL的离心管中，在吸附膜中央加入20μLTE，静置1min后（或稍长），12000g离心1min。（8）弃去吸附柱，将含回收产物DNA的1.5mL离心管贮存于-20℃。四、

4、回收产物的连接反应体系：回收纯化产物+ddH2O*5ulpMD18-T载体0.1μLMix5μLTotal10μL于16℃下连接8h，如有必要可以过夜连接。*注意：此处看回收纯化产物的浓度来调节ddH2O的用量，总量5μL五、热击转化六、阳性克隆的鉴定随机挑取白色菌落于含有200mlLB液体培养基（含相应抗生素）的0.5mL离心管中，37℃、225r/min摇动培养3~4小时后，用特异引物进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物，鉴别出有正确插入片段的阳性重组克隆，送样测序注：此处注意加相关对照，一般采用相同的片段大小来鉴定挑取的单克隆是否为目的基因。附录：大肠杆菌

5、感受态细胞的制备（1）挑取大肠杆菌DH10B的单菌落或者取未经污染的原菌0.5μL，接种到3μLSOB液体培养基中，37℃225r/min培养14~16小时。（2）取出2mL转接到200mL新的SOB培养基中，继续培养约3小时至对数生长期（OD550=0.8）。（3）冰上冷却10分钟后，4℃，7000g离心5分钟，弃上清，用10%甘油洗沉淀两次，每次离心收集，把沉淀物分装保存于-70℃备用。