药典三部(2015版)-通则-3407外源性DNA残留量测定法

《药典三部(2015版)-通则-3407外源性DNA残留量测定法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、3407外源性DNA残留量测定法在进行外源性DNA残留量测定时，可根据供试品具体情况选择下列任何一种方法进行测定。第一法DNA探针杂交发供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定条件下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA，称为杂交。将特异性单链DNA探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交，并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照比对后，可测定供试品中外源性DNA残留量。试剂⑴DNA标记和检测试剂盒⑵DNA杂交膜尼龙膜或硝酸纤维素膜。⑶2%蛋白酶K溶液称取蛋白酶K0.20g，溶于灭菌

2、水（电阻率大于18.2MΩ·cm）10ml中，分装后贮藏于﹣20℃备用。⑷3%牛血清白蛋白溶液称取牛血清白蛋白0.30g，溶于灭菌水（电阻率大于18.2MΩ·cm）10ml中。⑸1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH8.0）用适宜浓度盐酸溶液调pH值至8.0。⑹5.0mol/L氯化钠溶液。⑺0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）用10mol/L氢氧化钠溶液调pH值至8.0。⑻20%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液用盐酸调pH值至7.2。⑼蛋白酶缓冲液（pH8.0）量取1mol/LTris溶液1.0ml（pH8.0）、5.0mol/

3、L氯化钠溶液2.0ml、0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2.0ml、20%SDS溶液2.5ml、加灭菌水（电阻率大于18.2MΩ·cm）至10ml。如供试品遇氯化钠溶液发生沉淀反应，可免加氯化钠。⑽TE缓冲液（pH8.0）量取1mol/LTris溶液（pH8.0）10ml、0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2ml，加灭菌水（电阻率大于18.2MΩ·cm）至1000ml。⑾1%鱼精DNA溶液精密称取鱼精DNA0.10g，置10ml量瓶中，用TE缓冲液溶解并稀释至刻度，摇晃，用7号针头反复抽打，以剪切DNA成为小分子，分

4、装后贮藏于﹣20℃备用。⑿DNA稀释液取1%鱼精DNA溶液50μl，加TE缓冲液至10ml。用于探针标记和阳性对照的DNA制备用于探针标记和阳性对照的DNA，由生产供试品用的传代细胞、工程菌或杂交瘤细胞提取纯化获得，其提纯和鉴定可参考下述推荐方案进行，具体方法可参考《分子克隆实验指南》（［美］J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002）或《精编分子生物学实验指南》（［美］F.奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，科学出版社，1998）。将待提取的细胞基质悬液的细胞浓度调整为每1ml约含107个细胞，如果为细菌，则将其浓度调整为每1ml约含108个细

5、胞。量取悬液1ml，离心，在沉淀中加裂解液400ul混匀，37℃作用12～24小时后，加入饱和苯酚溶液450μl，剧烈振摇混匀，以每分钟10000转离心10分钟，转移上层液体，以饱和苯酚溶液450μl重复抽提1次；转移上层液体，加入三氯甲烷450μl，剧烈振摇混匀，以每分钟10000转离心10分钟；转移上层液体，加入pH5.2的3mol/L醋酸钠溶液40μl，充分混合，再加入﹣20℃以下的无水乙醇1ml，充分混合，﹣20℃以下作用2小时，以每分钟15000转离心15分钟；用适量﹣20℃70%乙醇溶液洗涤沉淀1次，以每分钟15000转离心15分钟，弃上

6、清液，保留沉淀，吹至干燥后，加适量灭菌TE缓冲液溶解，RNase酶切，苯酚-三氯甲烷抽提，分子筛纯化DNA，即得。用1%琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法鉴定阳性对照品的DNA纯度；应无RNA和寡核苷酸存在；A260/A280比值应在1.8～2.0之间（测定时将供试品稀释至A260为0.2～1.0）。用于阳性对照和标记探针的DNA在使用前应进行酶切或超声处理，使其片段大小适合于DNA杂交和探针标记。阳性对照品的DNA浓度按下式计算：DNA浓度（μg/ml）=50×A260阳性对照品可分装于适宜的小管中，﹣20℃以下保存，长期使用。探针的标记按试剂盒使用说明

7、书进行。测定法⑴蛋白酶K预处理按下表对供试品、阳性对照和阴性对照进行加样，混合后于37℃保温4小时以上，以保证酶切反应完全。加样量2%蛋白酶K溶液蛋白酶缓冲液3%牛血清白蛋白溶液加水至终体积供试品100μl1μl20μl200μlD1100μl1μl20μl适量200μlD2100μl1μl20μl适量200μlD3100μl1μl20μl适量200μl阴性对照100μl1μl20μl适量200μl注意事项供试品的稀释根据成品最大使用剂量，用DNA稀释液将供试品（原液）稀释至每100μl含1人份剂量；如成品最大使用剂量较大，而供试品的蛋白质含量较低，

8、可用DNA稀释液将供试品稀释至每100μl含1/10人份剂量或每100μl含1/100人份剂量。D1、D2、