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《外源性DNA残留量测定法(qPCR法)》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体外源性DNA残留量测定法(qPCR法)1原理实时定量PCR（qPCR）扩增分2个阶段，指数增长阶段和之后出现的非指数平台阶段。在指数增长阶段，每个循环PCR产物量大约增加一倍。然而，随着反应的进行，反应体系组成成分的消耗，其中的一种或多种成分限制反应，产物增长速度变慢，反应进入平台期。反应最初，虽然产物呈指数增长，但是荧光处于背景水平，检测不到荧光增加。但积累了足够的扩增产物，才可检测到的荧光信号，这个循环数叫初始循环数，即CT。CT值主要由扩增反应体系中模板的初始浓度决定的。如果模板初始浓度高，只需要较少的扩增循环就可以积累足够的产物，产生
2、高过背景的荧光信号，因此，反应就有一个小或早出现的CT；相反，如果模板初始浓度低，需要较多的扩增循环才能产生高过背景的荧光信号，反应就有一个大或迟出现的CT。两者之间关系的建立是qPCR用于定量的依据。2主要仪器表2仪器信息表名称厂家型号实时定量PCR仪Bio-RadCFXConnect3主要试剂表3试剂信息表名称厂家规格残留DNA样品制备试剂盒ABI1）LysisBuffer,2bottles,50ml/bottle;2）BindingSolution,1emptybottle;3）WashBufferConcentrate,2bottles,26ml/bottle;4）Elut
3、ionBuffer;1bottle,25ml;5）ProteinaseK(PK)Buffer,1bottle,50ml;6）MagneticParticles,2tubes,1.5ml/tube;7）ProteinaseK,2tubes,20mg/ml,1.25ml;8）YeasttRNA,2tubes,10mg/ml,0.5ml;Glycogen,2tubes,5mg/ml,1.0ml/tube.残留DNA定量检测试剂盒（CHO）ABI1)DNAControl,1bottle,40μl;2)DNADilutionBuffer(DDB),1bottle,7ml;3)2×Enviro
4、nmentalMasterMix,2tubes,0.75ml/tube;4)10×DNAResl-TimePCRAssayMix,1tube,300μl;5)NegativeControl,1tube,1.0ml.4溶液配制4.1蛋白酶K混合液（新配）附件13-14重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体外源性DNA残留量测定法（qPCR）1reaction（100μl/sample）10reaction（100μl/sample）ProteinaseK10μl100μlProteinaseKBuffer60μl600μl4.2裂解混合液（新配）试剂体积（μl）Glycogen（5
5、mg/ml）180tRNA（10mg/ml）4LysisBuffer7600合计77844.3DNA标准品稀释TubelabelDilutionpg/μlpg/reactionDNAControl30000300000SD110μlDNAControl+990μlDDB3003000SD250μlSD1+450μlDDB30300SD350μlSD2+450μlDDB330SD450μlSD3+450μlDDB0.33SD550μlSD4+450μlDDB0.030.3SD650μlSD5+450μlDDB0.0030.03NTCDDB00注：DNA标准品溶液4℃放置保存1天，-2
6、0℃放置保存1周。5测定方法5.1样品处理5.1.1除蛋白1）在2ml离心管中加入100μl样品；2）每100μl的样品中加入70μl的蛋白酶K混合液，混合均匀，56℃水浴30min；3）每100μl的样品中加入360μl的裂解液，室温裂解2小时以上。5.1.2DNA的纯化1）磁珠使用前于37℃温浴10min，高速涡旋，彻底悬浮磁珠；2）每100μl的样品加入30μl的磁珠悬浮液；3）每100μl的样品加入300μl的BindingSolution，涡旋混合5min；4）12000r/min离心30sec，将离心管放置于磁力架上，静置5min直至溶液清澈，弃上清；5）从磁力架上取下
7、离心管，加入300μl的WashBuffer，涡旋混合5sec；6）12000r/min离心30sec，将离心管放置于磁力架上，静置2min，弃上清；7）重复步骤6）1次，打开离心管的盖子，室温下风干；8）加入50μl的ElutionBuffer，高速涡旋10sec，70℃处理10min，在温浴过程中，涡旋2~3次；附件13-14重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体外源性DNA残留量测定法（qPCR）9）12000r/min离心30sec，将离心管放置于磁力架上，
