高通量测序技术与在肿瘤研究中的应用剖析

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1、高通量测序技术及其在肿瘤研究中的应用汇报人：目录背景介绍1测序的流程2对肿瘤研究的方法3总结4一、背景介绍高通量测序技术（High-throughputsequencing）又称“下一代”测序技术（“Next-generation”sequencingtechnology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(nextgenerationsequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录

2、组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。什么是高通量测序?第二代测序第三代测序第一代测序传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们的基础上发展来的测序技术统称为第一代测序。它在分子生物学研究中发挥过重要的作用，如人类基因组计划主要包括罗氏454公司的454测序技术、Illumina公司的Solexa测序技术和ABI公司的SOLiD测序技术。第二代测序技术最显著的特征是高通量，一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序第三代DNA测序技术是以单分子测序为特点，如生物科学公司的单分子测序仪，以及正在研制的太平洋生物科学公司的单

3、分子实时DNA测序技术和牛津纳米孔技术公司的纳米孔单分子测序技术等2005年开始20世纪80年代中期正在研发测序的发展历程目前常说的高通量测序是指用第二代测序技术来进行测序，第三代测序技术还不是很成熟，有的刚刚出现，有的则正在研制公司平台名称测序方法检测方法大约读长优点相对局限性Roche/454基因组测序仪FLX系统焦磷酸测序法光学230-400在第二代中最高读长；比第一代的测序通量大样品制备较难；难于处理重复和同种碱基多聚区域；试剂冲洗带来错误累积；仪器昂贵IlluminaHiSeq2000,HiSeq2500/MiSeq可逆链终止物和合成测序法荧光/光学2x150很高测序

4、通量仪器昂贵；用于数据删节和分析的费用较高ABI/Solid5500xlSolid系统连接测序法荧光/光学25-35很高测序通量；在广为接受的几种第二代平台中，试剂成本最低测序运行时间长；读长短，造成成本高，数据分析困难和基因组拼接困难；仪器昂贵第二代主要的测序平台主要的测序平台数据分析样品的制备文库的构建二、测序流程测序的流程上机测序Descriptionofthecompany’sproductsDescriptionofthecompany’sbusinessDescriptionofthecompany’stechnologyDescriptionofthecompan

5、y’scontents1.对测序后生成的数据进行分析2.普通的分析：去除低质量数据，进行序列组装，评估测序质量等3.高级分析：对基因进行注释，分析表达情况、构建互做网络等1.在第二代测序仪上进行测序，设定程序1.DNA序列打断、RNA序列要反转录为DNA序列再打断（超声破碎）200-300bp2.加接头，电泳选择片段大小3.PCR扩增，转到Flowcell上4.文库质检（QPCR)1.组织样品的培养或病理样品的收集2.样品总DAN、RNA的提取3.质检（总量、纯度、完整性、有没有降解等）三、对肿瘤研究的方法DNA1.实体肿瘤基因组学研究2.血液肿瘤基因组学研究3.表观遗传学研究

6、4.免疫组学研究高通量测序在肿瘤研究的应用RNA1.实体肿瘤转录组学研究2.血液肿瘤转录组学研究3.Exosome研究肿瘤细胞通讯、扩散机制DNA方向1.实体肿瘤基因组学研究一.研究目的和意义寻找适用于肿瘤早期诊断、肿瘤分型、病程发展（恶化和转移）和预后的基因组分子标记，筛选药物的靶标。二.研究对象实体肿瘤的鉴别，按照临床病理分类，例如：肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌、膀胱癌、食道癌、肾癌等。三.测序方案Exomecaptureseq（外显组捕获测序）描绘基因组外显子区域的SNV（单核苷酸变异），Indel（插入缺失）、CNV（拷贝数变异），分析基因变异和癌症

7、的相关性。Targetcaptureseq（目标捕获测序）对一些功能富集的基因或研究人员感兴趣的基因组的部分区域进行捕获，分析基因变异对癌症的影响。例如：癌症相关基因（508个）、免疫（883个）、凋亡（1536个）、细胞周期（1005个）、p53通路（162个）等。Wholegenomeseq（全基因组测序）对基因组上所有的基因进行测序分析，找到大量的SNV、CNV、Indel、SV（结构变异）等基因变异信息，更为全面的解析癌症发生发展的分子机制。四.案例解析1.外显组测序鉴定体细胞突变2