5 高通量测序技术在肿瘤基因检测中的应用-易鑫

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1、高通量测序技术在肿瘤基因检测中的应用易鑫精准检测是精准医学的基础目录CONTENTS1肿瘤高通量测序技术流程简介2高通量检测灵敏度与测序深度的关系•样本要求3ctDNA测序与低频突变检测•杂交捕获还是PCR扩增•测序平台的选择4肿瘤高通量测序的临床应用•高通量测序检测突变类型•常用生物信息分析软件与数据库高通量测序肿瘤基因检测流程介绍个体配对正常对照肿瘤病理组织/手（白细胞、癌旁）术标本/血浆/体鉴别真正的体细胞突变液等肿瘤突变正常多态性DNAProton测序Illunima测序肿瘤突变注释打断/无需打断不

2、打断遗传解读、用药选择原始下机数据目标区域捕获PCR扩增（液相杂交）生物信息分析MuTect＋GATKSomaticIndel＋Contra…文库制备肿瘤高通量测序的样本样本类型DNA量：>10~30ng对照样本纯度问题1234对检测结果影响肿瘤组织不同样本类型、白细胞优于癌旁很大，是重要的•••检测灵敏度对样组织质控点穿手病本起始量要求不刺术理同组织：肿瘤组织标标切本本片>70%为宜血浆：避免白细胞基血浆（ctDNA）因组的降解稀释胸腹水脑脊液（直接影响检测灵敏尿液等度和准确性）富集技术的选择扩增子or杂

3、交捕获评价目标区域富集技术的关键点·覆盖度（coverage):测序数据覆盖区域/探针or引物设计区域·特异性（specificity):目标区域测序数据/总数据·均一度（uniformity):目标区域碱基覆盖度的波动情况·重复性(repeatability)：重复实验的波动情况方法基于杂交捕获基于扩增子SureSelectSeqCapHaloPlexAmpliseqTruseq代表品牌(Agilent)(Roche)(Agilent)（Thermo)(Illumina)富集时间长长短短短流程复杂度高高低

4、低低捕获区域全外显子全外显子全外显子全外显子<0.5M模板量50ng(QXT)100ng100ng50ng50ng特异性低低高高高覆盖度好好好好好均一度高高低低低SNV（点突变）✔✔✔✔✔CNV（拷贝数变异）✔✔较差较差较差SV（融合基因）✔✔✗✗✗其它方面比较：•扩增子引物结合区域突变位点难以检测•PCR引物区域会测序数据的浪费•扩增子覆盖度不均一会导致低覆盖区域Calling准确性的下降拷贝数变异（CNV）检测精度的比较打断PCR捕获不同引物结合效率可能存在较大差异不同探针结合效率差异不大CNV检测精度

5、：杂交捕获显著优于扩增子建库测序平台的选择IlluminaThermo比较SNV******相近InDel****Thermo对于连续相同碱基的读取错误率略高准确性CNV******相近SV******相近易用性******相近读长******相近通量******各种通量机型可灵活选择时间*****Thermo在测序时间上具有一定优势成本******相近Thermo乳液PCR技术对插入片段长度存在一定限制应用*****Thermo无法双端测序，存在一定应用限制SNV精度检测，两个平台检测精度相当肿瘤体细胞突

6、变SNV数据分析原理突变T（肿瘤）N（对照）突变类型50%0%体细胞突变GT50%50%生殖细胞突变ScienceTranslationalMedicine15Apr2015:Vol.7,Issue283拷贝数变异(CNV)检测的原理影响CNV检测的因素：实验的重复性不同类型样本基线的建立CNV本身的大小融合基因检测示意图常用生物信息软件与数据库•数据分析软件：BWA＋GATKSuiteforGermlineVariantsMuTect/GATKSomaticIndel/ContraforSomati

7、cVariants•公共数据库：•肿瘤突变相关数据库：•临床用药信息数据库：高通量测序的检测灵敏度Sanger测序：10-15%ARMSPCR检测：1%ddPCR检测：0.1%高通量测序：？高通量测序检测灵敏度与测序深度的关系50%5/50%=10X10%5/10%=50X5条Reads确定测序深度决定检测一个可信突变灵敏度1%5/1%=500X0.1%5/0.1%=5000X1%的肿瘤含有该突变肿瘤50%的数据利用率最少5条reads确定一个突变样本（肿瘤的纯度、取样方式影响非常大）Y=5/0.5/0.0

8、1=1000X测序数据错误产生的原因成簇错误文上库机制测备合成错误序PCR扩增错误下机数据的背景错误在0.1%~1%之间0.1%~1%的背景错误使高通量测序对0.1%以下的突变成像错误检测面临挑战液体活检-ctDNA检测肺癌KRAS乳腺癌甲基化黑色素瘤BRAF结直肠癌KRAS肝癌/卵巢癌TP53胰腺癌KRAS乳腺癌TP531948年首次描述了游离核酸存在于人的血液中；1994年癌症患者血液中检测到重要癌基因R