基因组文库的构建与应用研究进展

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1、一.基因组文库的构建和应用研究进展随着后基因组学时代来临，克隆、研究并利用生物的重要基因、研究它们的结构、功能和进化己经成为遗传学领域的热点之一。和原核生物相比，真核生物基因组结构复杂，研究起来较为困难。随着大片断DNA克隆技术的发展核完善,构建真核生物大片断DNA的基因组文库，并以之为平台进行基因组序列测定、物理作图、基因分离、以及基因结构核功能的分析等研究，已经成为真核生物基因组研究中行之有效的方法⑴。基因组文库是指含有某种牛物全部基因的随机片断的重组DNA克隆群体。这个文库象是一个贮存有基因组全部序列的信息库，故称为基因

2、组文库(genomiclibrary),又称为人工构建的基因“活期储蓄所”(genomicbank)。人们既可以通过基因组文库的构建、贮存和扩增特定生物基因组的全部或部分片段，同时又能够在必需时从基因组文库中调出其中的任何DNA片段或目的基因⑵。1基因组文库的产生和发展克隆载体作为基因组文库构建的重要媒介，提高其容纳量一宜是重要发展方向之一。自1973年Cohen构建了第一个质粒载体pSIOl以来，越来越多的克隆载体相继岀现，使得克隆载体的整体结构和克隆效率有了很大改善。载体的发展大致经过三个阶段:第一代是以入噬菌体和粘粒为代

3、表的载体；第二代的代表为YAC(yeastartificialchromosome)BAC(bacterialartificialchromosome)及PAC(Pl-derivedartificialchromosome)；第三代为BIBAC(binaryBAC)及TAC(transformation-competentartificialchromosome)为代表的新型文库载体，不仅具有第二代载体的所有特征，而且具备了植物的转化功能⑶。入噬1.1第一代载体体是最早使用的克隆载体，其插入片断仅20kb左右⑷。1979年Ro

4、yal等确定了在粘粒(Cosmid)载体中克隆大片断的可能性⑸。此后粘粒载体用于构建果蝇、小鼠、人等基因组文库，并从这些文库中成功分离得到基因。肺炎支原体基因组全序列的测定就是粘粒文库的基础上完成的®铁粘粒是用包含九噬菌体cos位点的质粒。载体长4〜6kb,平均插入一般为40kb左右。重组的粘粒可承载外源DNA片段，并象入噬菌体一样感染大肠杆菌，在细菌细胞中复制和增殖。粘粒载体优点在于稳定性好，嵌合体少。缺点是插入片断过小，若用于染色体步行(chromosomewalking)则所需步彳亍次数太多，很大程度限制了它的应用。1•

5、2第二代载体第二阶段的克隆载体与第一代载体相比，显著特点是载体的容载能力扩大。酵母人工染色体YAC是最早发展的真止意义上的人工染色体，具备在寄主细胞中稳定地复制和遗传所必须的三个元件：复制起始区(originofreplication),参与染色体DNA复制起始结构的形成；着丝粒(centromere),负责染色体向子细胞的传递；端粒(telomere),对染色体DNA两个末端起封口和保护作用⑼。酵母人工染色体的平均插入片段可达到1Mb左右，因此构建基因组文库时，只需要较少的克隆数便可以覆盖整个基因组。因此YAC很快成为构建复

6、杂基因组DNA文库的主要载体系统。在人类基因组计划的早期，YAC文库被用于基因组框架的构建“叭虽然YAC能容载较大的片段，但同吋也有一些自身难以克服的缺点：一是嵌合现象的存在。即一个YAC克隆中的插入子可能来自两个或多个不同的片段,嵌合体的比例达到40%〜60%,这种现象使染色体步行和基因分离难度加大；二是YAC克隆的稳定性差，插入片段存在重排(sequencerearrangement)和丢失(insertdeletion)现彖，这对染色体物理图谱的构建和基因分离都十分不利；三是插入片段的分离和纯化困难；四是不能采用电转化，

7、转化效率低。这些缺点限制了YAC的应用llu,2JO因此科学家开始把眼光转向寻找更好的载体系统。1992年BAC载体应时而生口。细菌人工染色体(BAC)是以大肠杆菌致育因子(F因子)为基础的合成载体。F因子具有稳定遗传的特点，其复制是严谨型的，在每个细胞屮仅有1〜2个拷贝，减小了插入片段发生重组的机率，理论上F因子能够携带1Mb的外源片段,在实际应用中克隆的平均大小约为120kb,个别BAC重组子中含有的基因组DNA最大可达300kbo虽然容量没有YAC载体大，但BAC载体拥有YAC载体所缺乏而科学家所需的多个优点：一是以大肠

8、杆菌为寄主，采用电转，转化率高，因此构建BAC文库比YAC文库更容易；二是BAC载体以环型超螺旋状态存在，从大肠杆菌中提取质粒较方便，载体中的lacZ元件使人们能够利用颜色差异区分重组子，限制性位点能够用于大片段基因组DNA的克隆。三是BAC的复制子来源于F因子，可稳定遗传，