复合因素对小鼠病毒性肝炎湿热证的影响

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1、复合因素对小鼠病毒性肝炎湿热证的影响复合因素对小鼠病毒性肝炎湿热证的影响摘要：目的建立小鼠病毒性肝炎的湿热证模型，为中药应用于湿热证治疗提供模型基础。方法将小鼠随机分为正常组、单纯湿热组、病毒组、模型组。采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测小鼠肝脏病毒含量。对各组小鼠进行症状、肝功能、肝脏病理学改变等方面比较。结果病毒组、模型组小鼠的肝功能存在不同程度的损害。2组肝组织均有不同程度病理改变，以模型组病变更严重。用RT-PCR检测造模后血清病毒滴度，病毒组、模型组无明显差异，病毒含量2.9X104-5.5X104拷贝数/niL。结论初步构建小鼠病

2、毒感染的湿热证模型，该模型的发病条件、病变程度及主耍症状、体征均近似于中医湿热证特征，操作简单，重复性好，有较高的应用价值。关键词：肝炎病毒；动物模型；湿热证；小鼠D0I：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.06.012中图分类号:R285.5文献标识码:A文章编号：1005-5304(2013)06-0032-03温病湿热证是由湿热病邪引起的急性外感热病，其中“必发热”为温病湿热证区别于内伤杂病湿热证的关键。与温热类温病比较，其病理具有起病较缓、病势缠绵、病程较长之特点；与内伤湿热证比较，具有温病起病较急、来势较猛、传变较快、

3、变化较多之特点［1］。其病因与发病正如薛生白所言：“太阴内伤，湿饮停聚，客邪再至，内外相引，故病湿热。”强调“内外合邪”、“同类相召”是发病之关键。本实验在肥甘饮食+湿热环境+生物致病因子的共同作用下致温病湿热证模型，从症状、组织病理学等方面对温病湿热证模型进行观察和评价。1实验材料1.1动物4周龄，SPF级，雄性BALB/c小鼠40只，购自广东省医学实验动物中心。动物合格证号：0046987c1.2试剂与仪器MIIV-A59病毒由南方医科大学公共卫生与热带医学院微生物系病毒研究所提供；液氮、甲醛、无水乙醇：上海试剂一厂；0.9%氯化钠溶液、2.5%戊

4、二醛、2%戊巴比妥由广州中医药大学温病教研室提供;二甲苯、Harris苏木精液、伊红染色液、1%盐酸；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。高脂饲料及普通饲料均由广东省医学实验动物中心提供。植物生长气候箱、手术器械、研钵、直灌胃针、金属夹、石蜡油、一次性注射器（1、5、10mL）,以及0.5、1.5mLEppendorf管购口美国AEGEN公司；TP1020自动脱水机、RM2135Leica切片机、HI1210Leica摊片机、HI1220Leica烘片机、EG1160Leica自动包埋机等。2实验方

5、法2.1造模参考文献［2］方法，所有动物正常饲养于实验动物房，适应性喂养3d,无不良反应，即纳入实验。4周龄SPF级BALB/c雄性小鼠40只，随机分为4组，每组10只。正常对照组：正常饮食，同步饲养；单纯湿热组：肥甘饮食，每日在人工热气候模拟舱中热暴露6h（温度32°C±0.5°C,湿度90%±5%）,连续13d；病毒组：正常饮食、饮水13d,于第11H经腹腔接种鼠肝炎病毒MIIV-A590.5mL（预实验确定最佳攻毒浓度为10-2）；模型组：肥甘饮食，每日在人工热气候模拟舱中热暴露6h（温度32°C±0.5°C,湿度90%±5%）,连续13d,于第

6、11日经腹腔接种鼠肝炎病毒MIIV-A590.5mL（浓度为10-2）o并观察各组动物的症状（纳呆，便澹或便秘，倦怠）、饮水量、饮食量、体质量、肛温及死亡等变化。2.2标本米集第14H全部小鼠乙醴麻醉后摘取眼球采集外周血，离心后收集血清，放入-70°C低温冰箱保存，待测ALT、AST,剩余血清标木做病毒滴度测定。采血后脱椎处死小鼠，剖开腹腔，迅速取各组肝左叶组织1块，面积约5mmX5mm,置于10%中性甲醛溶液中

7、古

8、定，石蜡包埋，切片，经二甲苯脱蜡、梯度酒精序列脱水、HE染色，光学显微镜下观察其组织形态学改变。2.3指标检测2.3.1肝脏组织病理学观

9、察光学显微镜下观察各组肝组织形态学改变。炎症活动计分和纤维化计分标准［3］：炎症活动计分分为汇管区炎症（P）、小叶内炎症（L）、碎屑样坏死（PN）、桥接坏死（BN）4项，每项根据病变程度分别计1〜4分，因为已、BN严重度与预后直接相关，计分公式为P+L+2PN+2BN。纤维化计分分为中央静脉周和窦周、汇管区及纤维隔3项，并依据病变程度计1〜4分。见表1。2.3.2小鼠肝脏酶学检测采用全自动牛化仪检测各组小鼠ALT、ASTo2.3.3组织RNA提取将样品组织挑入已高压灭菌过1.5mLEppendorf管中，每管加1niLDEPC水，混匀，吸去上清，重复以

10、上操作；将冲洗后的组织挑出，加液氮，研碎；将研磨好样本放入新的1.5mLEppendorf管，