细胞分子生物学（扬州大学）细胞分子生物学实验

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质粒DNA的小规模制备课程名称：细胞分子生物学实验学时：3学时一、实验目的1•了解碱裂解法制备质粒DNA的基本原理；2.掌握碱裂解法的具体操作方法和注意事项。二、实验原理（或背景知识》碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异來分离它们。在pH值介于12.0〜12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分了RNA,蛋白质・SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。三、实验材料（-）仪器1•微量移液器（20|iL,200pL,1000|iL）2.恒温摇床3.台式高速离心机4.高压蒸汽灭菌锅（二）材料_1・含pUC18质粒的E.coliDH5a菌株2.1.5mLeppendorf管及管架、tips3.葡萄糖、三疑甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙酸钾、冰乙酸、乙醇、盐酸（HC1）、饱和酚、氯仿、界戊醇、ddH2O（三）试剂1.LB液体培养基蛋白豚10g酵母提取物5g NaCl10g溶于800mLddHpO中，用1ONNaOH溶液调节pH至7.5,加去离子水至总体积1L,高压灭菌20分钟。2•溶液I50mmol/L葡萄糖5mmol/L三瓮甲基氨基甲烷（Tris）TrisHCl10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）3•溶液II0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合4•溶液III5mol/L乙酸钾60mL冰乙酸11.5mLddH2O28.5mL5.RNaseA溶液RNaseA溶于lOmmol/LTris・Cl(pH7・5)、15mmol/LNaCl中，配成1Omg/mL的溶液，100°C煮沸15mino6.TE缓冲液10mmol/LTrisHCllmmol/LEDTA（pH8.0）7.70%乙醇（放・20°C冰箱中，用后即放冋）8.氯仿溶液氯仿：异戊醇=24：1（体积比）实验内容1.将菌种接种于LB液休培养基中，37°C振荡培养过夜。2.取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中，12000rpm离心30s。3.吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。4.将细菌沉淀悬浮于lOOpL冰预冷的溶液I屮，剧烈振荡。5.加200|iL溶液II（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上3min。6.加入150pL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5mino7・12000rpm,离心5min,将上清夜转至另一Eppendorf管中。8・加入RNaseA溶液2pL,37°C作用30min,去除RNA。9.加入等体积饱和酚/氯仿溶液（约400mL）,振荡混匀，12000rpm离心5mim小心移出上层水相于一新Eppendorf管屮。10.向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，・20°C放置10〜15min。12000rpm离心lOmino倒去上清夜，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。11.用ImL70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，离心，倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥。12.50卩LTE缓冲液，使DNA完全溶解，・20°C保存。 五、讨论分析1.实验操作过程中有哪些注意事项？1•质粒质量好坏与哪些操作步骤有关?六、成绩评定：1.能认真预习实验内容，教师提问优秀者占总成绩20%o2.动手能力好、能独立操作且操作正确占总成绩40%o3.报告清晰、结果正确、并有一般讨论分析占总成绩30%。4•讨论分析有参考文献、具有创新意识者占总成绩10%。 DNA限制性酶切及电泳分析课程名称：细胞分子生物学实验学时：3学时一、实验目的1.理解和掌握限制酶消化DNA的基本原理和方法；2.掌握琼脂糖凝胶电泳的操作步骤、凝胶的染色及注意事项。二、实验原理（或背景知识〉DNA限制性内切酶能特异切割某一核昔酸序列，从而形成亍磷酸基团和39轻基的结构。而酶切后的线性DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动吋有电荷效应和分子筛效应。DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖■磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。三、实验材料（一）仪器1•恒温水浴锅1.移液器1•琼脂糖凝胶电泳系统2•凝胶成像系统（二）材料1.上次实验所提取的质粒DNA2•限制性核酸内切酶EcoRl2.三疑甲基氨基甲烷（Tris）、硼酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、漠酚蓝、蔗糖、琼脂糖、澳化乙锭、DNAmarker.ddH2O（三）试剂1.50XTAE配1000ml50XTAE（pH8.5）：Tris242g冰醋酸57.1mLNa2•EDTA•2H2O37.2g补ddH2O至1OOOmL2.6X凝胶加样缓冲液 澳酚蓝0.25%蔗糖40%3.浪化乙锭溶液（EB）0.5（ig/mlUi实验内容1.DNA酶切质粒DNAEcoRI5pL（约l|ig）lpL10XbufferH3yLddH2O21|1L37°C水浴锅中反应1小时。1.称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30mL1XTAE缓冲液，微波炉加热至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液2.将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子，将冷到60°C左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）4•待胶凝固后，取岀梳子，放在电泳槽内。2.加入电泳缓冲液至电泳槽屮。3.用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔屮（记录点样顺序及点样量）。4.接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当漠酚蓝染料移动到距凝胶前沿1〜2cm处，停止电泳。5.取岀凝胶，将其放在含有EB的水溶液里，染色15min后，在自来水中脱色1・2次，每次5mino6.凝胶呈像系统屮观察电泳结果。*按照被分离DNA的人小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量，可参照下表:琼脂糖凝胶浓度/%线性DNA的有效分离范围/kb0.35〜600.61〜200.70.8〜100.90.5〜71.20.4〜61.50.2〜42.00.1〜3 五、讨论分析1.DNA限制性内切酶酶切时，有哪些注意事项?2.核酸电泳时有哪些注意事项？3.DNA酶切后凝胶电泳，经EB染色后，紫外灯下未见到任何荧光条带，试分析原因。六、成绩评定：1.能认真预习实验内容，教师提问优秀者占总成绩20%o2.动手能力好、能独立操作且操作正确占总成绩40%o3.报告清晰、结果正确、并有一般讨论分析占总成绩30%o4•讨论分析有参考文献、具有创新意识者占总成绩10%o 大肠杆菌感受态细胞的制备课程名称：细胞分子生物学实验学时：2学时一、实验目的1.通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法及技术；1•了解实验操作过程屮的注意事项。二、实验原理（或背景知识》细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。其原理是细菌处于0°C,CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的轻基.钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42°C短吋间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。三、实验材料（-）仪器1.超净工作台2.离心机2•恒温摇床1.移液器<-）材料1・大肠杆菌DH5a菌种2.1.5mLeppendorf管及管架、tips、巴氏吸管、试管3.氯化钙（CaCl2）>胰蛋白腺、酵母提取物、氯化钠（NaCl）、ddH2O（三）试剂1・lmol/LCaCb溶液（高压灭菌）1.LB液体培养基在950mL去离子水中加入：胰蛋白腺10g酵母提取物5gNaCl10g摇动容器直至溶质完全溶解，用NaOH调节pH至7.0,加入ddH2O至总体积为IL,121°C湿热灭菌20mine 实验内容1・从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mLLB液体培养基的试管中,37°C振荡培养过夜。2.取0.1ml菌液转接到一个含有10mLLB液体培养基锥形瓶或100mL玻璃瓶中,37°C振荡培养2〜3ho(此时，0£>6ooS0.4〜0.5,细胞数务必<108/ml,此为实验成功的关键)。3・将菌液转入Eppendorf管，ImL/管，1OOOOrpm离心15s回收细胞。1.用冰预冷的0.1mol/LCaCl2500|iL悬浮沉淀。5・再离心15s(lOOOOrpm),回收细胞。6.再用冰预冷的O.lmol/LCaCb60gL重悬沉淀。7.在・4°C下可保存2周。五、讨论分析1・感受态细胞制备成功关键有哪些？2•要使感受态细胞转化效率较高，一般怎么处理？六、成绩评定：1.能认真预习实验内容，教师提问优秀者占总成绩20%o2.动手能力好、能独立操作口操作正确占总成绩40%o3.报告清晰、结果正确、并有一般讨论分析占总成绩30%o4.讨论分析有参考文献、具有创新意识者占总成绩10%o DNA重组、鉴定课程名称：细胞分子生物学实验学时：3学时一、实验目的学会重组DNA连接、转化以及重组质粒的鉴定方法。二、实验原理（或背景知识〉外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是DNA连接酶的作用下，有Mg'SATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且口噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物；然后，酶-AMP复合物再结合到具有5,磷酸基和3,瓮基切口的DNA±,使DNA腺昔化；最后，产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过（牛小肠碱性磷酸酶）CIP处理克服。连接反应的温度在37°C时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12〜16°C,连接12〜16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，乂兼顾到短暂配对结构的稳定。垂组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用a互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段犬肠杆菌P半乳糖昔酶的启动子及其a肽链的DNA序列，此结构称为lacZ，基因。LacZ，基因编码的a肽链是p半乳糖昔酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的卩半乳糖昔酶分子。厶acZ，基因编码的a肽链与失去了正常氨基端的卩半乳糖昔酶突变体互补，这种现象称为a互补。由a互补而形成的有功能活性的卩半乳糖昔酶，可以用X-gal（5■淒4・氯弭朵■卩・D・半乳糖昔）显色出来，它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5■漠・4■靛蓝。因此，任何携带着/gqZ，基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种p半乳糖昔酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的卩半乳糖昔酶，在IPTG（异丙基硫代P・D■半乳糖昔）诱导后，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当 有外源DNA片段插入到位于lac乙中的多克隆位点后，就会破坏a肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的卩半乳糖昔酶和互补的活性a肽，而导致不能形成有功能活性的卩半乳糖昔酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。挑取部分白色菌落，接种含特定抗生素的培养基，待细菌长浓后，碱裂解法小提质粒，用合适的限制性内切酶酶切重组质粒，凝胶电泳分析，进一步鉴定重组质粒。三、实验材料（-）仪器1.微量移液器（20卩L,200卩L,1000yL）2.恒温摇床3.台式高速离心机4.高压蒸汽灭菌锅5•恒温水浴器（二）材料1.EcoRI酶切、纯化好的目的DNA及pUC19质粒、制备好的DH5a感受态细胞2.1.5mLeppendorf管及管架、tips、培养皿、接种环、玻璃涂棒、试管、酒精灯等3.膜蛋白腺、酵母提取物、氯化钠（NaCl）、氨节青霉素、琼脂粉、IPTG、X-gal.ddHzO、EaRI酶、T4DNA连接酶（三）试剂1.10X氨节青霉素贮存液（100mg/mL）：0.5g氨节青霉素粉溶于5mL的灭菌ddH2O即可。2.LA液体培养基：LB培养基中加入氨节青霉素至终浓度100ug/mLo3.X-gal：将X-gal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg/mL,不需过滤灭菌，分装小包装，避光贮存于-20°Co4.IPTG：取2gIPTG溶于8mL双蒸水中，再用双蒸水补至10mL,用0.22pm滤膜过滤除菌，每份lmL,贮存于-20°Co5.AIX琼脂板：12cm固体LB（液体LB培养基中加入1.5%的琼脂粉，高压灭菌后，待冷至50°C左右，浇成的琼脂平板）培养基表面均匀涂布氨节青霉素贮存液15|iL、X-gal16gL.IPTG3叫!1!实验内容1.将定量好的DNA片断及载体按照6:1的比例混匀，加入1|1LT4连接酶，lgLlOX连接缓冲液，使最终体积为10pL,16°C过夜。2.将连接产物加入已制备好的60|iL感受态细胞中，混匀后冰浴30min,同时做两个对照管：受体菌对照：60|iL感受态细胞+2（iL无菌水质粒对照：60|iL感受态细胞+1|1L环状质粒DNA溶液3.将连接管放到42°C水浴90s,再冰浴l-2min04.每管加800|iLLB液体培养基，37°C培养lh（慢摇）。。 1.将适当体积（200pL）已转化的感受态细胞，涂在AIX琼脂板中，倒置平皿37°C培养12〜16h,观察细菌生长情况。。2.挑取6枚白斑细菌，接种LA液体培养基，37°C250rpm培养10h左右呆细菌长浓后，碱裂解法小提质粒。3.去少量提取的上述质粒，EcoRl限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，判定阳性重组质粒。五、讨论分析1.目的DNA与载体连接后转化感受态细胞，但在固体培养基上未能长出菌落,试分析出现该情况的可能原因。2.重组载体的鉴定还有哪些方法？六、成绩评定：1.能认真预习实验内容，教师提问优秀者占总成绩20%o2.动手能力好、能独立操作且操作正确占总成绩40%o3.报告清晰、结果正确、并有一般讨论分析占总成绩30%。4.讨论分析有参考文献、具有创新意识者占总成绩10%o PCR基因扩增课程名称：细胞分子生物学实验学时：3学时一、实验目的1.理解PCR反应的基本原理；2.掌握PCR实验具体操作方法和注意事项。二、实验原理（或背景知识》多聚酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核晋酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。1.变性：加热使模板DNA在高温下（94°C）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2.退火：使溶液温度降至50〜60°C,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。3.延伸：溶液反应温度升至72°C,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核昔三磷酸（dNTP）,按5J3,方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段。上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循坏，样本屮的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25〜30个循环后DNA可扩增106〜IO?倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCb、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。三、实验材料（一）仪器1.微量移液器（20pL,200pL,lOOOgL）2.PCR热循环仪3.琼脂糖凝胶电泳系统1•凝胶成像系统（二）材料1.DNA模板2.PCR管及管架、tips3.dNTP混合物、合成好的引物、Taq酶、PCR缓冲液（含有Mg2+）.琼脂糖、 DNA相对分子量标准物、ddH2O（三）试剂 引物1、引物2将引物用ddH2O稀释至10pmol/pL!1!实验内容1.在0.5mlEppendorf管内配制251丄L反应体系：反应宓1体积/pLTemplate1ddH2O18引物11.0引物21.01Oxbuffer2.5dNTP1.0Taq酶0.52.按下列程序进行扩增：①95°C预变性5min②95°C变性lmin③55°C退火1.5min④72°C延伸1.5min⑤重复步骤次；⑥72°C延伸⑦4°ClOmin3.琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果配制0.7%琼脂糖凝胶，取5yL扩增产物屯泳，电泳结束后，EB染色，凝胶成像系统中观察记录结果。五、讨论分析1.PCR实验操作过程中有哪些注意事项？2.实验结果岀现多条条带，如何进行优化?六、成绩评定:1.能认真预习实验内容，教师提问优秀者占总成绩20%o2.动手能力好、能独立操作且操作正确占总成绩40%o3.报告清晰、结果正确、并有一般讨论分析占总成绩30%。4•讨论分析有参考文献、具有创新意识者占总成绩10%。 RNA的提取课程名称：细胞分子生物学实验学时：2学时一、实验目的1•了解细胞或组织的收获方法、保存注意事项；2.明确RNA提取试剂的要求及提取时注意事项。二、实验原理（或背景知识》由于RNA很易被外部环境中的RNA酶（RNase）降解，所有分离提取RNA的第一步操作都是在能导致RNA酶变性的环境屮裂解细胞，然后通过抽提、沉淀等步骤将RNA从各种生物大分子屮分离出来。RNase性质很稳定，且在切割RNA时不需要辅助因子的参与，因此RNA制剂中只要存在少量的RNase都会引起严重的后果。为了避免RNA酶的污染，实验中所用到的全部溶液、玻璃器皿、塑料制品都需要特别处理。由于手是RNase污染的主要来源之一，所以在整个RNA制备过程中必须戴手套操作。实验用的溶液均需用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理，以使RNA酶失活。玻璃器皿需在300°C干烤4h或180°C干烤8h,使其表面附着的RNase完全灭活。三、实验材料（-）仪器1•微量移液器（20,200gL,1000pL）2.高速冷冻离心机3.超净工作台（二）材料1.CEF细胞一瓶2.一次性PE手套、无RNase的eppendorf管及管架、tips3.焦碳酸二乙酯（DEPC）、Trizol试剂、氯仿（未拆封）、异丙醇（未拆封）、70%乙醇溶液、无RNase的ddH2O（三）试剂1.0.1%DEPC溶液：吸取1OO^LDEPC溶于1L的ddH2O,37°C振荡培养过夜后，高压灭菌即可。2.70%乙醇溶液：70mL无水乙醇+30mL无RNase的ddH2O（0.1%DEPC溶液）,混匀置-20°Co3・0.01MpH7.4PBS：NaCl8g KC10.2g Na2HPO41.42gKH2PO40.27g加去离子水800mL,充分溶解用HC1调节pH至7.4,再用去离子水补足lOOOmL,高压灭菌，室温保存。!1!实验内容1.将CEF从细胞培养瓶屮刮下，PBS洗涤1・2次后弃去上清。2•加入Trizol试剂ImL,吹打混匀,静置5-10mino1.加入200pL氯仿，剧烈手摇15s,室温下静置3min后4°C10000gX15min离心。2.小心吸取上清转移至另一无RNase的eppendorf管。3.加等体积的・20°C预冷的异丙醇，混匀后・20°C静置lOmino6・4°C10000gX15min离心。1.弃去异丙醇溶液，沉淀物用70%的乙醇溶液洗涤。2.弃去乙醇溶液，超净台屮吹15min,使残余乙醇挥发干净。9・用30|iL无RNase的ddH?。溶解RNA。四、讨论分析1.实验操作过程中有哪些注意事项?2.如何检测所提取RNA品质？五、成绩评定：1.能认真预习实验内容，教师提问优秀者占总成绩20%。2.动手能力好、能独立操作且操作正确占总成绩40%o3.报告清晰、结果正确、并有一般讨论分析占总成绩30%。4•讨论分析有参考文献、具有创新意识者占总成绩10%。