《细胞与酶固定化》PPT课件

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第一节概述第二节酶固定化第三节微生物、植物和动物细胞固定化第四节原生质体固定化第四章酶与细胞固定化 一、酶与细胞固定化的概念二、天然酶在应用中的一些缺陷三、固定化酶特点四、固定化酶的发展史第一节概述 一、酶与细胞固定化的概念借助各种物理或化学方法，将酶或细胞固定于水不溶性载体上的过程，称为酶与细胞固定化。水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术 二、天然酶在应用中的一些缺陷1、酶稳定性差，易变性失活2、酶和底物只能反应一次，难于回收利用，不仅成本高，而且难于连续化生产。3、反应液中混入酶蛋白，使产品的分离纯化复杂化。研究固定化酶，可使酶在应用上的这些不足得到改善。 1、不溶于水:反应完成后，经过滤或离心等简单分离，就可以回收，以重复使用，降低酶制剂成本。2、具有一定的机械强度:可将其装成酶柱，当底物溶液缓缓流经酶柱时，就能发生酶促反应，流出液中，即含有酶促反应产物，其产物不易带杂质，收率高，易精制。3、稳定性提高:一根酶柱往往可以连续使用数十次，而酶活力并无明显下降。三、固定化酶特点： 四固定化酶的发展史固定化酶(ImmobilizedEnzyme）是20世纪60年代发展起来的—项新技术。它是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶柬缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用；过去曾称其为水不溶酶或固相酶。1971年第一届国际酶工程会上正式建议采用固定化酶的名称。 一、基本概念1.固定化酶：固定在载体上，并在一定空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。（分离提纯的酶）2.固定化菌体：固定于载体上的菌体或菌体碎片，称为固定化菌体，它是固定化酶的一种形式。（菌体即死细胞或细胞碎片上的酶或酶系） ①物理吸附法通过载体表面和酶分子表面之间的氢键、疏水键和π-电子亲和力等物理作用力，将酶固定于不溶性载体（固体吸附剂）的方法，称为物理吸附法，简称吸附法。1、吸附法（1）原理 常用吸附剂：a.无机吸附剂：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微孔玻璃、羟基磷灰石，活性炭等。无机吸附剂的吸附容量一般很低，多在1mg蛋白/g吸附剂。b.有机吸附剂：纤维素、胶原、火棉胶等。有机吸附剂的吸附容量一般较高，如火棉胶膜吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸酯酶等，吸附容量为70mg蛋白/cm2膜。 是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如AmberliteXE-97、DoweX-50等。离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。②离子交换吸附法DEAE—纤维素吸附的α—淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶 （2）制备方法：a.静态法：在没有搅拌、振摇的情况下，将载体直接加入酶溶液，通过自然吸附、解吸、再吸附等过程、制备固定化酶。该法操作简便，但效率低，耗时，吸附量小且不均匀。b.电沉积法：在酶溶液中放置两个电极，在电极邻近加入载体，接通电源，酶移向电极并沉积到载体表面，以制备固定化酶。该法可提高吸附时局部浓度，增加吸附量，但要注意酶在电场中的稳定性。 c.混和振摇装载法：是实验室常用方法，载体与酶液混和后，要在搅拌下或摇床连续振摇下完成固定化。该法固定化较为均匀，要注意搅拌或振摇速率，既不破坏酶和载体结构，又要达到充分混和目的。d.反应器装载法：这是工业上常用方法，它将固定化和其后的应用连在一起，即先将载体装于反应器中，再加上酶液，然后通过循环流振动方式使酶和载体达到充分混和。 ①pH：影响载体和酶的电荷变化，从而影响酶吸附。②离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。③蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。④温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。⑤吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。⑥载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。（3）影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素: （4）吸附法的优点、缺点吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，易脱落，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。世界第一例获得工业应用的固定化酶是DEAE-SephadexA-25吸附的氨基酰化酶反应用于DL-AA的光学分析。 (1)基本概念：将酶或含酶菌体包埋于各种多孔载体中，使酶固定化的方法，称为包埋法。(2)包埋常用载体：琼脂、聚丙烯酰胺、海藻酸钠、琼脂糖、角叉菜胶等。(3)包埋法的类型：主要有胶格包埋、微囊型包埋、脂质体包埋。2、包埋法 a.胶格包埋或称凝胶包埋：①常用凝胶：天然胶：琼脂、海藻酸钙胶、角叉菜胶、明胶合成胶：聚丙烯酰胺、光交联树脂 ②制备方法：以天然胶为载体：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等先将这些天然物，溶于含水介质，然后再与酶液混和，最后分别通过各种方法，使之胶化，制成胶包埋的固定化酶。优点：包埋条件温和、操作简便、酶活影响小缺点：强度差如：胶原可以添加丁醇；角叉菜胶（卡拉胶）：卡拉胶(K—Carrageenin)是由角叉菜(又名鹿角菜:Cawageen)中提取的一种多糖。具体方法：将100g酶在37～50℃溶于水中，又将1.7g卡拉胶在40～60℃溶于34ml生理盐水中，二者混合后冷全10℃，所成凝胶浸在0.3mol/LKCl溶液中硬化，作成适当大小的颗粒，即为固定化酶。海藻酸可添加氯化钙，使之以胶的形式沉淀下来。 以合成胶为载体（如聚丙烯酰胺凝胶）：先将酶和丙烯酰胺单体分散于水介质中，然后加入聚合促进剂和N.N’-甲叉双丙烯酰胺聚合，酶即包埋于形成的凝胶中。特点：合成胶强度高，对温度、pH变化耐受性强，但要控制好包埋条件。 b.微囊型包埋又称半透膜包埋法：将酶包埋于由各种高分子聚合物（直径几十微米～几百微米，厚约25mm的半透膜）制成的小球内，制成固定化酶。半透膜孔径<酶分子孔径，小于半透膜孔径的小分子底物和产物可以自由进出，被称为“人工细胞”。①常用半透膜有：聚酰胺膜、火棉胶膜②制备方式：相分离法、界面聚合法、表面活性剂乳化液包埋法。分述如下： 相分离法：利用高聚物在水相和有机相的界面上溶解度降低而凝聚，易形成皮膜而将酶包埋于中。例：以火棉胶（硝酸纤维素）包埋酶时，先将酶的水溶液在含有硝酸纤维素的乙醚溶液中乳化、分散，然后再加入苯甲酸丁酯，促使硝酸纤维素在酶液液滴周围凝聚，最后用Tween20破乳化后，就可得到含酶的火棉胶囊。 界面聚合法：利用在微滴的界面通过加成或缩合反应形成水不溶性多聚体制成微囊包埋酶。例：以尼龙膜包埋酶时，将酶液及亲水性单体（如己二胺）溶于水制成水溶液。另外，将疏水性单体（癸二酰氯等）溶于氯仿或甲苯等与水混溶的有机溶剂。然后，将这两种互不相溶的液体混和在一起。加入乳化剂乳化，使酶液分散成小液滴。此时，亲水性的已二胺与疏水性的癸二酰氯就在二相界面聚合成半透膜，将酶包埋在小球内。再加Tween-20，使乳化破坏，用离心分离即可得用半透膜包埋的微囊型固定化酶。 表面活性剂乳化液膜法：在酶的水溶液中添加表面活性剂，使之乳化形成液膜达到包埋的目的。该法不含化学反应，简便，而且固定化是可逆的，但有渗漏的可能性。 C、脂质体包埋：将酶包埋于脂质体(Liposome)中的方法。脂质体是指具有脂双层结构和一定包囊空间的微球体。脂质体包埋的特点：具有一定的机械性能，能定向将酶等被包裹物携带到体内特定部位，然后将被包裹物质释放。因此，其在药物应用方面受到重视。 包埋法的优点、缺点:包埋法的优点在于它是一种反应条件温和、很少改变酶结构但是又较牢固的固定化方法。包埋法的缺点是只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶并不适合。这是由于高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变，使活力降低。 (1)基本概念：选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键，与酶结合在一起的固定化方法，称为结合法。(2)类型：根据酶与载体结合的化学键不同，结合法分为离子键结合法和共价键结合法。3、结合法 离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法，称为离子键结合法。常用载体：不溶于水的离子交换剂。DEAE-纤维素TEAE-纤维素DEAE-葡聚糖凝胶 制备方法：在一定pH、温度、离子强度等条件下，将酶液与载体混和搅拌几个小时，或将酶液缓慢流过处理好的离子交换柱，使酶结合于离子交换剂上而制得。特点：活力损失小，但由于离子键结合，结合力弱，酶与载体之间结合不牢固，在pH，离子强度等条件改变时，酶易脱离。 纤维素琼脂糖胶葡聚糖凝胶甲壳质氨基酸共聚物甲基丙烯醇共聚物常用载体芳香氨基羟基羟甲基氨基载体上的功能基团酶分子上的非必需侧链基团游离氨基胍基酚羟基巯基咪唑基羟基b、共价键结合法（共价偶联法）：通过共价键，将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联以制备固定化酶的方法。 制备方法：由于载体上的功能基团与酶分子上的侧链基团间不具有直接反应的能力，因此在偶联反应前，需先进行载体活化，在载体上引进某种活泼基团，然后此活泼基团再与酶分子上某一基团反应形成共价结合。载体活化的方法很多，分述如下： ①重氮法：这是带芳香氨基载体的主要反应，即载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物，然后再在温和的条件下和酶分子上相应的基团如酚羟基、咪唑基或氨基直接进行偶联。常用的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等（见示意图） 反应式及原理 ②叠氮法：此反应适用于含羟基、羧甲基等的载体，如CM-纤维素、葡聚糖、聚氨基酸、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等。以羧甲基纤维素为例，可先在酸等作用下转变为叠氮衍生物，这种产物能在低温、pH7.5～8.5的情况下和酶的氨基直接偶联。但叠氮衍生物也能和羟基、酚羟基或巯基反应。 用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下：⑴酯化:CM-纤维素先洗涤干燥，然后悬于无水甲醇中，在冰浴中通入HCl气体，进行酯化反应；然后洗涤，空气干燥。⑵肼解:把酯化后的CM-纤维素悬于甲醇中，再加入80%水合肼回流反应1小时，过滤，洗涤干燥。⑶叠氮化:肼解后的CM-纤维素（1g）加入150ml2%HCl在冰浴中混合，搅拌滴加9ml3%NaNO2反应20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶(4)偶联:经叠氮化后的载体加入0.05NpH8.0磷酸缓冲液（内含250-500mg酶），5℃搅拌2-3小时，过滤，用0.001NHCl，水洗涤，即为固定化胰蛋白酶（冻干保存） ③溴化氰法：带羟基的载体如纤维素、葡聚糖和琼脂糖等常用的反应。在碱性条件下载体羟基和溴化氰（CNBr）反应生成极活泼的亚氨碳酸基，它在弱碱中可直接和酶的氨基进行共价偶联反应。 ④烷基化法：含羟基的载体也可在碱性条件下和均三氯三嗪等反应，在引入活泼的卤素后能直接与酶的氨基、酚羟基或巯基等偶联。 ⑤异硫氰酸法：含芳香氨基的载体也可先用硫光气处理成异硫氰酸(或异氰酸)盐的衍生物，这样得到的产物极易在温和条件下和酶分子的氨基反应。由于在中性pH条件下优先和α-氨基反应，因此可进行选择性偶联。 共价结合法特点：结合很牢固，酶不会脱落，可以连续使用较长时间。但载体活化的操作复杂，同时由于共价结合时可能影响酶的空间构象而影响酶的催化活性共价偶联反应中的保护措施：化学偶联反应一般比较激烈，为了减少酶在偶联过程中失效，应采取如下保护措施： ①选择适宜的固定化方法与相应的载体。例如：采用重氮法时要注意载体的亲水性与疏水性；②严格控制反应条件，提高反应的专一性。例如：使反应局限于α-氨基，保护ε-氨基；③应用可逆抑制剂或底物，封闭或牵制酶的活性中心与必需基团，避免试剂影响酶的活性构型和相应基团。例如：在进行腺三磷酶(ATPase)固定化时，可先用对羟汞苯甲酸(PHMB)将酶的活性巯基保护起来，然后通过叠氮反应将酶偶联于羧甲基纤维素上，在完成固定化以后，再用还原剂使-SH活化，这样可得到高活性的固定化酶。 4、交联法（1）基本概念利用双功能试剂或多功能试剂在酶分子间，酶分子与惰性蛋白间，或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法。 （2）常用双功能和多功能试剂：双功能试剂：戊二醛、双重氮联苯胺-2-2’-二磺酸多功能试剂：甲苯-2-异氰-4-异硫氰其中最常用的是戊二醛 （3）制备方式利用戊二醛两个醛基都可与酶蛋白分子的游离氨基反应，形成Schiff碱，从而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。在没有其它载体参与，仅通过酶分子间交联形成的固定化酶，颗粒很小，而且机械性能不佳，为克服这一缺点，一般可先将酶吸附于载体上，或者包埋于胶内或微囊内，然后再交联制成固定化酶“网”膜或“网”颗粒。这种方法又称为双重固定化法。 5、热处理法将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。热处理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。例如：将培养好的含葡萄糖异构酶的链霉菌细胞在60～65℃的温度下处理15min，葡萄糖异构酶全部固定在菌体内。热处理法也可与交联法或其他固定化法联合使用，进行双重固定化。 酶分子经固相化后，从游离态变为结合态。酶分子处在一个与游离态酶完全不同的微环境中，微环境的许多性质会影响酶原有的性质。如微环境的化学组成，与酶相结合的表面结构，底物进入与底物排出微环境的速度，微环境的局部pH等。三、固定化酶的性质 就载体物化性质和固定化过程影响而言，主要存在以下三种影响效应：分配效应、空间障碍效应、扩散限制效应。分配效应：由于载体和底物的性质差异引起了微环境和宏观环境之间的性质不同。微环境是在固定化酶附近的局部环境，而将主体溶液称为宏观环境。由这种不同造成的底物、产物和各种效应物在两个环境之间的不同分配，被称为分配效应。 空间障碍效应：固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制（因为载体的空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位造成了空间屏障），使酶分子的活性基团不易于底物或效应物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用，所造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效应。 扩散限制效应：酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产生了扩散阻力。①外扩散阻力：底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过程中的一种扩散限制效应，它发生在反应之前，发生在固定化颗粒周围的液膜层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。②内扩散阻力：指底物分子达到固相酶表面后传递到酶活性部位时的一种扩散阻力，它与催化反应同时进行。载体小而弯曲的细孔是产生内扩散阻力的要原因。因此使用低分子量底物，小的粒径、载体孔尽可能大而直且互相连通，或仅仅将酶固定在载体表面都可以降低这种内扩散阻力。 1、稳定性固相酶的稳定性比游离酶高，主要表现在以下几个方面。（1）热稳定性：固定化酶热稳定性较之天然酶提高。如氨基酸酰化酶 (2)对蛋白酶水解作用稳定性：固相酶比天然酶有更强的抵抗蛋白酶水解作用的能力。 (3)对变性试剂作用的稳定性：固相酶对各种蛋白变性剂的稳定性，一般都比天然酶强。 (4)保藏稳定性：固相酶比天然酶保存的时间更长。如：天然胰凝乳蛋白酶在pH4.1，4℃保存4个月，残留活力仅为原活力的2%。偶联于琼脂糖后，在同样条件下，却可保存82%的活力，因此固相酶有利于运输、贮存和重复使用。 固定化后酶稳定性提高的原因：①固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子伸展变形。②抑制酶的自身降解。③固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。 2、最适温度（1）固相酶的最适温度一般比天然酶高，个别会有所降低。例如：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其作用的最适温度比游离酶高5～10℃；以共价结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高5～15℃。 （2）同种酶，采用不同的方法或不同载体固定化后，其最适温度可能不同。如：氨基酰化酶用DEAE-葡聚糖凝胶经离子键结合法固定化后，其最适温度(72℃)比游离酶的最适温度(60℃)提高12℃；用DEAE-纤维素固定化，其最适温度(67℃)比游离酶提高7℃；用烷基化法固定化的氨基酰化酶，其最适温度却比游离酶则有所降低。 3、最适pH酶经固定化后，其作用的最适pH常会发生偏移，影响固定化酶最适pH的因素主要有两个。(1)载体性质对最适pH影响：用带负电荷载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶最适pH高。用带正电荷载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶最适pH低。用不带电荷载体制备的固定化酶，最适pH一般不改变。 影响的原因：因为固相酶颗粒在水溶液中，是被一层几乎不流动的液体包围着，这层不流动液体叫做扩散层，扩散层与其周围外部溶液之间存在着杜南（Donnan）平衡效应，即若是多阴离子载体就会吸引溶液中的阳离（如H+），使其附着于载体表面，导致扩散层的H+浓度比其周围外部溶液高，于是扩散层pH值就比外部溶液pH值低。因此，外部溶液的pH必须向碱侧偏移，才能抵消微环境作用，使固相酶达到最大效率，因此使用带负电荷的载体制备的固相酶，其最适pH比游离酶高。反之，亦然。 （2）产物性质对最适pH影响若酶催化反应产物为酸性时，固定化酶最适pH比游离酶的最适pH要高。若酶催化反应产物为碱性时，固定化酶最适pH比游离酶的最适PH要低。若酶催化反应产物为中性时，固定化酶最适pH不变。 影响的原因：由于微环境扩散限制影响，嵌在载体中的酶，当其催化反应产生酸性产物时，产物的扩散活动受到微环境的约束和限制，使产物不易扩散出去，以致在微环境中，出现局部pH浓度梯度，越靠近微环境表面的地方pH越低。这时，外部环境的pH就要提高一点，才能抵消微环境的这种作用，使酶达到最适pH。 4、底物特异性固定化酶底物特异性与游离酶相比，有一定变化，一般为：作用于小分子底物的酶类经固定化后，专一性基本不变。而既可作用大分子也可作用小分子底物的酶类经固定化后专一性会发生变化。如：胰蛋白酶既可作用于高分子的蛋白质，又可作用于低分子的二肽或多肽，固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游离酶的3％左右.以羧甲基纤维素为载体经叠氮法制备的核糖核酸酶，当以核糖核酸为底物时，催化速度仅为游离酶的2%左右，而以环化鸟苷酸为底物时，催化速度可达游离酶的50～60％。 影响原因：固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。酶固定在载体上以后，使大分子底物难于接近酶分子而使催化速度大大降低，而分子量较小的底物受空间位阻作用的影响较小或不受影响，故与游离酶的作用没有显著不同。 5、米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化（1）载体与底物带相同电荷，Km’>Km固定化酶降低了酶的亲和力。（2）载体与底物电荷相反，静电作用，Km’