《酶法分析》PPT课件

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1、第四章酶分析法酶分析法：酶活力测定（酶研究的一部分）酶法分析（酶作为分析的工具）前者的目的在于检知样品中某种酶的含量或活性，后者则主要用于测定与生物学有关的样品中酶以外其它物质的含量。两者检测对象不同，但原理基本一致：酶的专一性、高效性，通过酶反应速度测定物质的变化进行定量分析。酶分析（EnzymeAssay）以酶为分析对象，目的是检测食品、药物体液等生物样品中酶的含量或活性；如：血液中谷丙转氨酶、淀粉酶等测定；葡萄糖氧化酶生产发酵液中葡萄糖氧化酶活力测定等；酶法分析（ENZYMEANALYSIS）酶法分析是一种以酶为分析工具（分析试剂）的分析法，分析

2、的对象可以是底物、辅酶、活化剂、酶抑制剂。主要用于测定与生物样品有关的样品中酶以外其他物质的含量。常用于食品、药物、体液等样品中成分含量检测如血糖、胆固醇等测定。第一节、酶活力的测定一、酶活力测定（一）基本定义二、酶活力（一）酶活力酶活力activity：酶催化一定化学反应的能力。用酶催化的反应速度来表示酶活力，即用单位时间内，单位体积中底物的减少量或产物增加量来表示。转换频率：单位时间转化的底物分子数。Kcat,单位1/s（二）酶活力单位及比活力酶活力单位U（activeunit）：是根据某种酶在最适条件下，单位时间内被酶作用的底物的减少量或产物的生

3、成量来规定的，表示酶活力高低。IU：umol/minKat：mol/s1Kat=6×107IU酶的比活力指每mg酶蛋白（或每mg蛋白氨）所含的酶活力单位数即：比活力=活力单位数/酶蛋白（氮）mg表示酶制剂的纯度，比活力愈高，酶愈纯。（二）测定方式有二：1.测定一定时间内的化学反应的量通常测定在一定时间内最适于酶的条件下酶促反应产物的生成量。如蛋白酶的活力，可据酶催化酪蛋白水解生成的酪氨酸与酚试剂作用蓝色反应，再用比色法测定之。2.测定完成一定量反应所需的时间，测定酶所催化的一定量底物的减少或一定量产物的生成所需的时间，酶活力与之成反比。测酶活力就是在确

4、定的最适反应条件下测定酶促反应速度，酶促反应速度取决于那些因素？——速度方程测定酶活力的基本要求：1、要使反应系统中除待测酶浓度是影响反应速度的唯一限制性因素（反应速度定量酶活力）；2、其余一切均应最适合于酶发挥作用（表现最大能力）；所以，要建立一个酶活力测定方法，要针对以下几方面做工作：底物？pH？温度？样品？二、测定中应注意的问题1.初速度底物浓度对酶速的影响浓度选择：a）[s]>=100Km；b）有时不宜采用高底物浓度（有毒性、价高、溶解度小、抑制酶反应等)则根据具体条件，通过实验选一适当浓度。作用于待测酶产物的其它酶；（如腈水合酶与酰胺酶）其

5、它因素。空白是指待测酶反应以外的其它反应（杂酶、自发反应）引起的变化量空白值可通过不加底物、不加酶、或两者都加而预先使酶失效而测定例如：GPT测定中——先不加底物；酸性磷酸酯酶中——先不加酶；对照是指用标准酶（或纯酶）测得的结果，与样品酶对照来定量。三酶活力的测定方法（一）终止法是使酶促反应进行一定时间后，终止其反应，再用化学或物理方法测定产物或底物变化的量。三酶活力的测定方法（二）动力学法是连续测定酶反应过程中底物、产物或辅酶的变化量，可以直接测定酶促反应的初速度。三酶活力的测定方法（三）酶偶联法指选择另一种酶与酶发生偶联反应，即第一种酶E1所催化的

6、产物作为E2的底物，通过测定第二个酶促反应产物的量变化来测的活力，此法适用于活力不高或所催化产物不便测定的一些酶活力测定。ABCE1E2被测反应的产物是某脱氢酶的底物,即B是脱氢酶E2的底物,测定系统中加入足量的脱氢酶E2和NADH,使反应进行到C,然后通过NADH的特征变化而测知。G+ATPG-6-P+ADPHK被测反应：偶联指示反应：G-6-P+NADPNADPH+6-PGCOOH（关键是工具酶的专一、高纯、且过量，以保证被测反应的v是总反应系统中的限速因子，测得的指示反应速度和E1浓度间呈线性关系）G6PDH举例：α-淀粉酶活力测定1.标准碘液法

7、原理：淀粉对碘呈蓝黑色的特异性逐渐消失，消失的速率与酶活性有关。方法：终止法稀盐酸测吸光度2.DNS法α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。方法：终止法热变性测吸光度第二节酶法分析在进行酶法分析时，先要根据分析对象选择适它的“工具酶”，然后再通过酶反应的测定，并借助相应的校正曲线来检知它们的浓度或含量。在上述几种检测对象中，除了底物可以采用总变量分析法（终点法）外，其它都只能用动力学分析法。条件：和酶活力测定的基本相同，但其所用的酶量必须一定，除了相应的被

8、测因素的浓度应控制在限速水平以外，其它反应成份均须保证处于恒定和最适。应用时应考虑两个问题，即