DB21∕T 2252-2014 O型口蹄疫病毒RT-PCR检测方法

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1、ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2252—2014Ｏ型口蹄疫病毒RT-PCR检测方法MethodofRT-PCRforthedetectionoftypeOfootandmouthdiseasevirus2014-03-07发布2014-05-07实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2252—2014Ｏ型口蹄疫病毒RT-PCR检测方法1范围本标准规定了Ｏ型口蹄疫病毒（FMDV-O）RT-PCR检测方法的实验材料、仪器设备、试剂、操作步骤和结果判定，并介绍了其原理。本标准适用于动物及动物产品中Ｏ型口蹄疫病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是

2、必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范3缩略语下列缩略语适用于本标准。DEPC焦炭酸二乙酯RNA核糖核酸RT-PCR反转录聚合酶链反应dNTP脱氧核苷酸三磷酸bp碱基对Ｏ-P液牛、羊食道-咽部分泌物4原理FMDV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据FMDV-O保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸

3、起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。5实验材料、仪器设备和试剂5.1实验材料眼科剪、眼科镊、称量纸、1.5mL灭菌离心管（经DEPC水处理）、0.2mL薄壁PCR管、琼脂糖、500mL量筒、500mL三角瓶、吸头（10µL、200µL、1000µL）。5.2仪器设备1DB21/T2252—2014分析天平、低温高速离心机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、－70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、－20℃冰箱、可调移液器（最大量程分别为2µL、20µL、200µL、1000µL）。5.3试剂5.3.12.5mmol/LdNTP。

4、5.3.2引物：上游引物5′-AGATTTGTGAAAGTAACACCA-3′，下游引物5′-CATGTCCTCTTGCATCTGGTT-3′。5.3.310倍PCR缓冲液。5.3.41%溴化乙锭（EB）溶液（见第A.1）。5.3.5电泳缓冲液（50倍）（见第A.2）。5.3.61%琼脂糖凝胶（见第A.3）。5.3.775%乙醇（见第A.4）。5.3.8灭菌DEPC水（见第A.5）。5.3.9上样缓冲液(见第A.6)。5.3.10电泳缓冲液（1倍）（见第A.7）。5.3.11磷酸盐缓冲液（0.04mol/L、pH7.4）（见第A.8）。5.3.12其他试剂：10U/µLAMV反转录酶

5、、50U/µLRNA酶抑制剂、5U/µLTaqDNA聚合酶、异丙醇、25mmol/L氯化镁溶液。注：除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682－1992的灭菌双蒸水或超纯水。6操作步骤6.1样品的采集、保存运送和处理6.1.1样品采集6.1.1.1水泡液：未破裂水泡中的水泡液用灭菌注射器吸出后装入灭菌小瓶中（可加青霉素1000UI/mL，链霉素1mg/mL），加盖密封，编号。6.1.1.2水泡皮：剪取新鲜水泡皮3～5g放入灭菌小瓶中，加6～10mL（2倍体积）50％甘油－磷酸盐缓冲液(0.04mol/L、pH7.4),加盖密封，编号。6.1.1.3肌肉或组织样品：无菌采

6、集淋巴结、脊髓、肌肉等组织样品3～5g装入洁净的小瓶内或其他灭菌容器，编号。6.1.1.4O-P液样品：被检动物在采样前禁食(可饮水)12小时，以免反刍胃内容物严重污染O-P液。采样探杯在使用前经0.2％柠檬酸或2％氢氧化钠浸泡5min，再用自来水冲洗。每采完一头动物,探杯要重复进行消毒和清洗。采样时动物站立保定，将探杯随吞咽动作送入食道上部10～15cm处，轻轻来回移动2～3次，然后将探杯拉出。如采集的O-P液被反刍胃内容物严重污染，要用生理盐水或自来水2DB21/T2252—2014冲洗口腔后重新采样。将探杯采集到的8～10mLO-P液倒入25mL以上的灭菌玻璃容器中,容器中应事

7、先加有8～10mL细胞培养液或磷酸盐缓冲液(0.04mol/L、pH7.4)，加盖密封后充分摇匀，编号。6.1.2样品保存与运送6.1.2.1样品保存：采集的样品冷藏送检或尽快冷冻保存，避免反复冻融。6.1.2.2样品运送：样品装入保温壶或保温桶中加冷冻剂和防震材料，加盖密封，以最快方式，运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。6.1.3样品处理6.1.3.1水泡液：不需处理，可以直接进行核酸提取。6.1.3.2水泡皮、