新型微流控混合芯片制备siRNA递送纳米载体的研究

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1、分类号：Ｒ９４单位代码：１０１８３研究生学号：２０１５３４２０７１密级：公开吉林大学硕士学位论文（学术学位）新型微流控混合芯片制备ｓｉＲＮＡ递送纳米载体的研究ＳｔｕｄｏｎＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｂａｓｅｄＬｉｉｄＮａｎｏａｒｔｉｃｌｅｓＳｎｔｈｅｓｉｓｙｐｐｙｆｏｒｓｉＲＮＡＤｅｌｒｉｖｅｙ作者姓名：王天鹏类别：微生物与理学硕士域（方向：新型给药系统指导教师：李剑光教授培养单位：生命科学学院２０１８年６月新型微流控混合芯片制备ｓｉＲＮＡ递送纳米载体的研究ＳｔｕｄｙｏｎＭｉｃｒｏ

2、ｆｌｕｉｄｉｃｂａｓｅｄＬｉｉｄＮａｎｏａｒｔｉｃｌｅｓＳｎｔｈｅｓｉｓｐｐｙｆｏｒｓｉＲＮＡＤｅｌｉｖｅｒｙ作者姓名：王天鹏领域（方向）：新型给药系统指导教师：李剑光教授类别：理学硕士答辩日期：ＸＨｔ年ｉ月Ｌ日未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租＼改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限〉。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：

3、所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：＞〇／？年５月ｈ日摘要中文摘要基于脂质纳米粒的小干扰RNA(siRNA)递送系统对肿瘤等多种疾病有着良好的治疗效果。传统的脂质体制备方法多依赖于宏观尺度的混合，步骤繁琐且重复性差。微流控技术（Microfluidic）可以实现微米尺度下流体的精确

4、操控，从而优化载体制备过程。然而，由于微流控芯片中流体处于层流状态，较低的混和效率制约了其在该领域的进一步发展。本课题中，我们设计了一种通道底部嵌有w状沟槽的微流控芯片。通道内的w状沟槽诱发液流发生混沌现象，极大增加了两相间接触面积，使得高效的混合在数微秒内即可完成。课题随后通过芯片制备了小粒径、单分散的转铁蛋白（transferrin,Tf）修饰脂质纳米粒，并从体外和体内水平对其递送siRNA的能力进行了评价。论文主要研究方法和结果如下：1.芯片设计及纳米粒制备表征本课题在PDMS芯片中加工200×75μm的矩形微通道，并在通道底部刻蚀w状沟槽，沟槽深3

5、5μm，宽50μm。由荧光混合效率实验可见微通道内流体的混沌现象被成功诱发。为优化所设计微芯片制备脂质纳米粒的条件，本论文对微通道内总流体流速(totalflowrate,TFR)，水脂相流速比(flowrateratio,FRR)和磷脂浓度三因素组合进行了优化。结果表明，微流控芯片在磷脂浓度为5mg/ml,TFR为735μl/min，FRR为20时制备的转铁蛋白修饰脂质纳米粒（microfluidicpreparedtransferrinlipidnanoparticles,M-Tf-LNPs）各参数最佳。此时M-Tf-LNPs平均粒径为110nm，多分

6、散系数（PDI）为0.15，比批量式（Bulk）乙醇注入法所制备的同处方纳米粒（B-Tf-LNPs）粒径小90nm左右，PDI小0.12。室温存放7天后，M-Tf-LNPs的粒径分布未发生明显变化。2.M-Tf-LNPs的体外抗肿瘤效果评价课题随后对所制备纳米粒的体外安全性、细胞摄取效率和转染效率进行了评价。MTT实验表明，加入M-Tf-LNPs空白载体培养24h后，HepG2细胞活力保持在90%以上，说明其良好的体外安全性。流式细胞术的结果表明，M-Tf-LNPsI摘要包载的FAM-siRNA可以在4小时内被细胞快速摄取。激光共聚焦显微镜观察可见，经M-

7、Tf-LNPs介导内化的siRNA主要分布于细胞质中。Westernblot评价转染48小时后蛋白敲除效率，结果显示经M-Tf-LNPs递送的siRNA可以有效降低HepG2细胞中的survivin蛋白表达。3.M-Tf-LNPs的体内抗肿瘤效果评价为评价M-Tf-LNPs在体内的siRNA递送效率，本文构建移植瘤小鼠模型并给以尾静脉注射纳米粒，以考察其体内组织分布情况、肿瘤生长抑制效率及体内生物安全性。组织荧光分布实验表明，包载Cy3-siRNA的M-Tf-LNPs在注射2小时后即开始于肿瘤部位蓄积，且在给药24小时后仍有较高的信号强度，这说明其良好的肿

8、瘤靶向性并能有效延长siRNA的体内循环时间。开始给药后，定期记录