dna分子测序技术的原理发展及应用1ppt课件

《dna分子测序技术的原理发展及应用1ppt课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、分子生物学讨论课发展及医学应用DNA测序基础的原理讨论组成员王苗苗岳莹莹谭辽吴兆平吕琳周雨馨洛桑次珍任怡君2021/8/52021/8/52021/8/5DNA测序技术的发展及原理DNA测序技术的发展DNA双脱氧链末端终止测序DNA化学降解测序第一代测序技术454焦磷酸测序第二代测序技术纳米孔单分子测序技术第三代测序技术2021/8/5在1977年，Sanger等提出了经典的双脱氧核苷酸末端终止测序法此后，在Sanger法的基础上，80年代中期出现了以荧光标记代替放射性同位素标记、以荧光信号接收器和计算机信号分析系统代替放射性自显影的

2、自动测序仪Sanger区别同一年（1977），Gilbert等提出了化学降解法。该方法与Sanger法类似，都是先得到随机长度的DNA链，再通过电泳方法读出序列。Gilbert二者的不同之处在于，Gilbert法是先用特定的化学试剂标记碱基再用化学方法打断待测序列，而Sanger法是通过ddNTP随机中断合成待测序列。第一代测序技术2021/8/5第一代测序技术●原理2.化学修饰法测序化学试剂处理末段DNA片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳分离。化学切割反应：包括碱基的修饰修饰的碱基

3、从其糖环上转移出去在失去碱基的糖环处DNA断裂。1.Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，

4、但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。2021/8/5第一代测序技术在化学降解测序法中,一个末端被放射性标记的DNA片段在5组互相独立的化学反应中分别被部分降解,其中每一组反应特异地针对某种碱基。因此生成5组放射性标记的分子,每组混合物中均含有长短不一的DNA分子,其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA片段上的位置。最后,各组混合物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,再通过放射自显影来检测末端标记的分子。化学降解法刚问世时,准确性较好,也容易为

5、普通研究人员所掌握,因此用得较多。而且化学降解较之链终止法具有一个明显的优点,即所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成产生的拷贝,排除了合成时造成的错误。但化学降解法操作过程较麻烦,逐渐被简便快速的Sanger法所代替。2021/8/5第二代测序技术第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等大量的测序工作，然而它依然存在很多问题经过不断的开发和测试，进入21世纪后，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二代测序技术诞生了。成本高速度慢具有生物学偏

6、好第二代测序技术的诞生第一代测序技术缺陷2021/8/5焦测序技术第二代测序技术它在DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下使引物延伸聚合脱氧核糖核酸（dNTP）释放焦磷酸盐（PPi）、PPi转换三磷酸腺苷（ATP）、ATP产生荧光信号与dNTP和ATP的降解等化学反应偶联起来检测结果准确可靠。2021/8/5●原理焦测序技术是一种基于发光法测定焦磷酸盐（PPi）的测序技术［3］。其原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶（polymerase）、三磷酸腺苷硫酸化酶（ATPsulfuryl

7、ase）、萤光素酶（luciferase）和三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）4种酶的协同作用下完成循环测序反应。当加入的dNTP与模板互补时，DNA模板与互补的dNTP聚合时可以产生等摩尔PPi，在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化下，PPi与5'-磷酸化硫酸腺苷（APS）反应生成等量的ATP；在萤光素酶催化作用下，ATP与虫萤光素（luciferin）反应发光，最大波长约为560nm，可用光电倍增管（PMT）或电荷耦合装置（CCD）检测。产生的荧光信号强度与聚合的dNTP个数成正比，根据加入的dNTP类型和荧光信号强度就可实时记录模板DN

8、A的核苷酸序列第二代测序技术2021/8/5第三代测序技术纳米孔测序技术该技术采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，因而可以在此基础上使用多种方法来进行