western blot实验步骤

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1、Westernbolt一、实验目的通过实验了解westernblot技术的原理和操作。二、实验原理SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙

2、稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。硝酸纤维素膜(nitrocellulosefiltermembrane，简称NC膜)，在胶体金试纸中用做C/T线的承载

3、体，同时也是免疫反应的发生处。NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。化学发光HRP底物（辣根过氧化物酶底物，也常被称为ECL试剂）是目前Westernblot检测中最为灵敏的试剂。显影液的A液主要成分为鲁米诺（Luminol）及发光增强剂，B液主要成分为过氧化物溶液。二抗上含有HRP（辣根过氧化物酶），可以催化A液和B液反应发光。三、实验器材1.电泳槽，胶板架子2.转膜仪3.NC膜4.电泳电源

4、5.滤纸6.摇床7.X射线摄影暗匣8.X射线胶片9.塑料薄膜四、实验试剂1.runningbuffer5xrunningbuffer(1L)Tris15.1gGlycine94.0gSDS5.0gddH2O定容至1L使用前稀释5倍2.Transferbuffer10×Transferbuffer(1L)Tris30.3gGlycine144.0gddH2O定容至1L使用前稀释10倍，加入1/4体积的甲醇3.TBS10×TBS(500mL)Tris12.1gNacl40.0gddH2O定容至500mL用HCl调节溶液的

5、pH值至7.64.TBST(1L)1×TBS:Tween-20=1000:1ddH2O定容至1L5.5%的脱脂奶粉溶液(50ml)脱脂奶粉2.5gTBST定容至50ml6.一抗溶液7.二抗溶液8.显影液现配现用，溶液A：溶液B=1:1配置。9.SDS-PAGE（配方见下一页）五、操作步骤1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1.1SDS-PAGE胶的配置①先清洗胶板，用去离子水冲洗后放在架子上待干。②准备好试剂。③计算所需要使用试剂的量。例：6%的分离胶，每块胶板分离胶约需要7ml，10块胶，共需要70ml④将胶板安装在架子

6、上，较低的板朝外，注意底部要平，以防漏胶。较高的板有正反之分，上面的“up”朝上。⑤准备配胶按照上面配方依次添加。注意：1.添加量少的试剂要注意混匀2.TEMED，APS要最后加⑥配好分离胶，将胶液注入胶板缝隙中。注意速度不能太慢，否则胶液会凝，越是浓度高的胶液凝的越快。⑦分离胶加入后，用异丙醇或水封平胶面，注意在加入异丙醇或水的时候要缓慢不要过分冲击胶，否则容易导致分离胶的液面两边凹陷或不平整。⑧半小时后观察分离胶是否凝结，左右轻轻倾斜胶板看是否有出现胶面晃动。凝结后，将异丙醇或水到掉，将架子倒置去除多余的异丙醇或

7、水。⑨配置浓缩胶，同配置分离胶相似，配方不同。配好后倒胶。每块胶用约3ml。注意不要到过多的浓缩胶，以防插梳子后胶会溢出，倒置在之后用胶前拔梳子的时候出现上扬孔破损现象。且倒胶后应尽快插梳子，注意梳子有正反。A.分离胶6%GEL5ml7ml8ml10mlH2O2.853.994.565.740%Acr/bis0.751.051.21.51.5Mtris-HCl（pH8.8）1.31.822.082.610%SDS0.050.070.080.110%AP（过硫酸铵）0.050.070.080.1TEMED0.0040.

8、00560.00640.0088%GEL5ml7ml8ml10mlH2O2.63.644.165.240%Acr/bis11.41.621.5Mtris-HCl（pH8.8）1.31.822.082.610%SDS0.050.070.080.110%AP（过硫酸铵）0.050.070.080.1TEMED0.0030.00420.00480.0