Western blot 操作步骤

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1、Westernblot操作步骤实验原理：   Westernblot，也称Westernblotting、蛋白印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Westernblot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异

2、性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。内参:     WB过程监测以及目的蛋白定量的标准；最重要和最不可或缺的对照就是内参照。1.内参可检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，如果一个实验连内参照都出不了阳性结果的话（在内参抗体有效的情况下），那么这个体系就是存在问题的；2、起半定量的标准的作用，内参一般选择管家基因编码表达的蛋白，在很多组织和细胞中都是稳定表达的，因此可以作为检测靶蛋白表达量的标准；内参名称分子量大小适用范围beta-actin43kDa胞浆和全细胞GAPDH30-40kDa胞浆和全细胞Tubulin55kDa

3、胞浆和全细胞VCDA1/Porin31kDa线粒体COXIV16kDa线粒体TBP38kDa细胞核  实验步骤一、蛋白样品制备（组织中总蛋白的提取）    第一步：    法（1）敲取0.07-0.1g组织+400-500ul裂解液，放入打样管，放入打样机打样。    法（2）实验室研钵研磨：取稍大于0.1g的样品放入研钵中，加少量液氮冻硬，用研杵来回研磨至粉末状，用枪头刮取收集入离心管。注：任何操作都要在液氮中进行，并且要将枪头和离心管提前泡在液氮中。第二步：取出的样品放置冰上1-2h（中间混匀5-6次）直至裂解完全。第三步：样品离心×2，取上清于新的

4、EP管中。（离心条件：13000rpm，4℃，30min）注：离心机提前预冷至4℃。二、蛋白含量的测定    第一步：在96孔板第一列1-8分别为浓度为0，1，2，4，6，8，9，10倍的蛋白标准液+水=10或20ml，再加上5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。第二步：在96孔板后面几列依次加入稀释的蛋白样品或原液10-20ml以及5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。注：原液浓度太高时进行稀释，用裂解液稀释。三、电泳   第一步：清洗玻璃板将玻璃板在蒸馏水下冲洗干净，去除杂质，再用去离子水清洗一遍，自然晾干。第二步：配胶   （1）玻璃板对齐后放入夹中卡

5、紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。       （2）配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。待胶面升到玻璃板3/4位置时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝固更快。注：加水液封时须缓慢，否则胶会被冲变形。   （3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固。倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。注：插梳子时要使梳子保持水平，两边对齐垂直插入。  （4）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，

6、大玻璃板面向外。若只跑一块胶，槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）    第三步：上样   （1）测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋白加入4：1 5×LoadingBuffer于离心管，100℃水中煮5min使蛋白变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4℃。   （2）加足够的1×电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要没过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。）第四步：电泳浓

7、缩胶80V电压跑20分钟，至蛋白marker分离即可加压，也可多跑几分钟；分离胶120V电压跑至底端。第五步：停止电泳纯水冲洗玻璃板，取胶，清洗切去浓缩胶，在Marker下方切角做标记，将胶泡在清水中。四、转膜（跑胶时准备转膜用品，最主要赶气泡）    第一步：剪PVDF膜，并提前切角标记方向，甲醇中泡1-3min。    第二步：将膜、海绵、滤纸一起泡入1×转膜液中，放4℃保存。    第三步：将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。)在垫子上垫2层滤纸，一手固定滤纸

8、一手用玻棒擀去其中的气泡。将胶盖于滤纸上，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜用镊子盖于胶上