粪便中芽孢杆菌的分离和鉴定

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1、粪便中芽孢杆菌的分离和鉴定一、实验原理：通过对粪便的处理，对其进行细菌分离，选择出芽孢杆菌。芽孢杆菌多为革兰氏阳性菌，需氧或者兼性厌氧。通过普通培养基进行细菌培养，观察其菌落的形态、特征。对典型的菌落进行革兰氏染色和芽孢染色。之后进行普通培养基、血琼脂培养基、固体培养基培养。之后进行过氧化氢、VP实验、淀粉水解、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、甲基红实验、吲哚产生实验、苯丙氨酸脱酸实验、葡萄糖的水解实验、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、乳糖的分解实验、液化明胶实验、硫铵水解实验等生理生化实验。对细菌进行16srDNA序列测序，测GC碱基的所占比例

2、、PCR测序，确定具体为何种芽孢杆菌，最后进行小鼠毒性实验。二、实验材料粪便锥形瓶、烧杯、载玻片、玻璃棒、胶头滴管玻、璃珠、培养皿、移液管、移液枪及枪头小试管、试管、细玻璃棒、接种环、接种针、搪瓷缸、水浴锅、纱布、冰箱、摇床、酒精灯、蒸馏水、无菌水、恒温培养箱、高压锅、电炉、pH试纸、PH计吸水纸、显微镜、秒表、天平、电子称、电子天平、温度计、记号笔、滤纸、塞子、纱布、冰箱PCR仪、微量移液器、一次性手套、小鼠、手术刀、注射器草酸铵结晶紫溶液、碘液、石碳酸溶液、95%酒精、碱性美蓝溶液、3%过氧化氢溶液、肌酸/肌酐、40%氢氧化钾、

3、无菌羊血清、3%淀粉溶液、柠檬酸钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、琼脂、磷酸一氢钾、氯化钠、溴麝香草酚蓝酒精溶液、硝酸钾、蛋白胨、1%氢氧化钠、对氨基苯磺酸、5mol/L醋酸、α-萘胺、脱脂棉、二苯胺、浓硫酸、葡萄糖、、甲基红溶液、DL-苯丙氨酸、酵母浸液、10%氯化铁、蔗糖、麦芽糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、甘露醇、0.2%溴麝香草酚蓝水溶液、1%溴麝香草酚蓝水溶液、HL-葡萄糖培养管、硫胨、牛肉膏、明胶、、对位二甲氨基苯甲醛、无水乙醇、青霉素、反应缓冲液、2mM脱氧核苷三磷酸底物、耐热DNA聚合酶、三、实验步骤3.1粪便的处理;取样品1g，加

4、至带玻璃珠的含100mL无菌水的锥形瓶中，静置20min后，在摇床上20r/min充分振荡30min，将样品液于80℃水浴15min，取10mL样品液均匀涂布在制备好的普通营养琼脂平板上，37℃过夜培养3.1.1普通肉汤培养基配方：牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、磷酸氢二钾1g、蒸馏水1000mL配制：按上述要求称量（先称盐类、蛋白胨、牛肉膏），至于铝锅或者搪瓷缸；将上述成分混合加热溶解后，以0.1mol/L氢氧化钠调整PH为7.4~7.63.1.2普通琼脂培养基的制作配方：普通肉汤500ml（牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、磷酸二氢

5、钾、蒸馏水）、琼脂10g（在液体培养基加入琼脂1.5%~2%为固体培养基、加入0.3~0.5%为半固体培养基）配制：1）将称好的琼脂加到普通肉汤内，加热煮沸待琼脂完全融化，分装试管或用于制备琼脂平板。分装试管每管约4~5ml。分装完毕塞好棉塞，包扎好待灭菌。2)高压蒸汽灭菌后，趁热将试管口的一端放在玻璃棒上，使之有一定的浓度，凝固后即成普通琼脂斜面。也可直立，凝固后即成高层琼脂。3)剩余部分的普通琼脂以手掌感触，若将琼脂瓶紧紧手中感觉烫，但仍能紧握时，即为倾倒平皿的合适温度（50~60℃）.每只灭菌培养皿倒入10~15ml，将培养皿

6、盖上，并将培养皿于桌面上轻轻回转，使培养皿平铺于皿底，即成普通琼脂平板。3.1.3鲜血琼脂培养基的制备1）将灭菌的普通琼脂培养基加热融化，待冷却至50℃，加入无菌的脱纤绵羊或者家兔的鲜血5%~6%混合后，分装灭菌试管，立即摆成斜面或者倾注于灭菌平皿（琼脂温度过高加入后为紫褐色，过低时鲜血加入不凝固，不易混合。混合时切勿产生气泡）。待凝固后，至37℃无菌检验24h，无杂菌生长方可应用。2）无菌血液采用无菌操作采自健康动物，将血液加到盛有5%灭菌枸橼酸钠或者3%灭菌肝素的100ml三角瓶内，至冰箱待用。3.2细菌的分离：将上清液接种于营

7、养肉汤，37℃,200r/min培养24h，,取培养液80℃水浴15min，杀死非芽孢杆菌，接种于营养肉汤，37℃，200r/min富集培养20h。3.3：细菌的纯化：取富集菌液梯度稀释10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，选择三个合适的梯度混菌划线分离（划线法先将平板置于30℃（24-48h）或37℃（18-24h），无菌检查，表面冷凝水干燥）。每个梯度二个平皿，将平板倒置，于35℃-37℃24-48h。对长出的单菌落进行编号，选择生长快、菌落大，表面干燥，粗糙，不透明的菌落转接于斜面培养。挑取少许菌苔涂片，做芽胞染色

8、判断是否为芽孢杆菌。3.3.1细菌的制涂片备：取一块干净的载玻片，各滴一滴无菌水于载玻片中央，用接种环以无菌操作法在火焰旁从菌种上挑取少许菌体于水滴中，混匀并涂成薄膜，干燥，固定。3.3.2革兰氏染色1）涂片、干燥、固定2）滴加草酸铵