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1、代谢通量分析一、研究背景和目的谷胱甘肽是生物体内的一种重要的活性三肽，由谷氨酸，半胱氨酸和高甘氨酸缩合而成。在生物体内对于维持机体适宜的氧化还原环境起着至关重要的作用。在临床上，谷胱甘肽是一种治疗肝病、肿瘤、中毒、白内障及衰老等疾病的重要生化药物，在食品添加剂和运动营养学上也备受关注，其需求量也不断增加。1、谷胱甘肽代谢网络结构模型依据六个条件（见文献）建立谷胱甘肽代谢网络结构及谷胱甘肽的生物合成途径（文献中图一），并列出胞内代谢反应方程（附表一）。2、代谢通量的计算先假设细胞内的中间代谢产物均处于拟稳态，这样由n个中间代谢产物
2、即可得到n个关于速率的约束条件，若选定的总数目为J,则待解问题的自由度为F=J讥这样通过实验测出F个不相关速率可确定整体通量分布。以xi表示代谢网络中第i种代谢物的积累速率，则有xi=Eajrj-Eakrk,式中rj表示生成第i种代谢物的第j个反应的通量，rk为消耗第i种代谢物的第k个反应的通量，aj和ak均为化学计量系数，xi、rj和rk为比速率。采用矩阵的形式（见文献）直观地表示出代谢物的积累速率，通过矩阵利用线性代数的知识测定葡萄糖消耗速率、细胞合成速率、谷胱甘肽牛成速率等。三、结果：一定的扰动对谷胱甘肽生物合成量的影响通
3、过添加L■半胱氨酸，半胱氨酸一方面用于谷胱甘肽的合成，另一方血也要用作前体参与细胞的合成，二者在一定条件下是相互矛盾的，即参与细胞合成的半胱氨酸多，则用于谷胱甘肽合成的半胱氨酸就相对较少,而这对于胞内谷胱甘肽含量的提高是不利的。在发酵后期向反应体系中以外加半胱氨酸的方式来补充半胱氨酸的供给，对于缓解胞内半胱氨酸的需求可能是有帮助的。由此可见，额外的半胱氨酸的供给使通往GC的碳通量（「62）增加将近1倍。因此最终谷胱甘肽的产量也以相应的倍数增加（增幅为91%）0另外，半胱氨酸补加的直接结果是导致了通往HMP途径的碳通量（门7）锐减
4、，这部分碳通量转而进入EMP途径和TCA循环，合成了更多的NADH和FADH2,由于半胱氨酸中筑基具有高度的还原性，因此半胱氨酸的补加也改变了发酵体系已有的氧化还原环境，此时用于细胞维持的ATP消耗也明显增加，增幅达到23%.四、与其他方法对于谷胱甘肽生物合成量影响的比较不同时间不同浓度过氧化氢胁迫和过氧化氢连续胁迫对产航假丝酵母合成谷胱甘肽⑴的影响，发现低浓度过氧化氢的连续胁迫对谷胱甘肽的合成有明显促进作用。进一步在发酵罐上应用了低浓度过氧化氢（36mmol/L）持续胁迫策略，最终谷胱甘肽产量为922mg/L,胞内谷胱甘肽含量
5、为1.64%,比对照分别提高了7%和35%.对细胞赋予短时间pH胁迫，以期提高其胞内谷胱甘肽［2］合成能力，并使谷胱甘肽向胞外分泌，从而改变谷胱甘肽在胞内外的分布和增加谷胱廿肽合成总量。在该发酵策略的控制下，谷胱廿肽总产量达到737.1mg/L.采用产航假丝酵母，在细胞高密度培养基础上，考察了半胱氨酸添加与溶氧控制及低pH胁迫对谷胱甘肽合成⑶的影响。结果表明，细胞高密度培养结束时(45h),—次性添加50mmol/L半胱氨酸，第60h时谷胱甘肽产量达1534mg/L.添加半胱氨酸后的3h内溶氧控制在5%,之后的12h将溶氧控制在
6、20%,可减少半胱氨酸添加量，而谷胱甘肽产量却提高13%.将30mmol/L半胱氨酸分2次添加并与pH胁迫和溶氧控制相组合，发酵结束时(78h),谷胱廿肽终产量达1936mg/L.五、总结通过在不同情况下谷胱甘肽生物合成量，可以明显看出，通过加入半胱氨酸可以显著提高谷胱甘肽的生物合成量；其次是低浓度过氧化氢也可以提高谷胱甘肽的合成量；低pH也可以用于提高谷胱甘肽合成量。但是，若多种方法结合一起使用，谷胱廿肽的合成量则提高的更显著:在培养的过程中，可以在不同阶段使用不同的调节方法，先用通过添加半胱氨酸，再控制洛氧，最后再低pH可使
7、谷胱甘肽的合成量高达1936mg/L•由此可见，不同的方法对谷胱甘肽的合成量影响不同，且添加半胱氨酸的方法更有效。六、参考文献⑴廖鲜艳,张文燕，朱至，陈坚，堵国成.过氧化氢胁迫促进产航假丝酵母合成谷胱甘肽［J］・生物工程学报,2008,24(6):1046-1050・［2］聂薇,卫功元，李寅，堵国成,陈坚.利用低pH胁迫作用促进产航假丝酵母生产谷胱甘肽卩］・化工学报,2005,56(9):1751-1756.⑶梁国，堵国成,陈坚.半胱氨酸添加与溶氧控制及pH胁迫相结合促进产月元假丝酵母合成谷胱廿肽［J］.过程工程学报,2009,
8、9(4):787-790.
