酶工程_05-酶分子修饰-2012

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1、酶工程EnzymeEngineering第五课酶分子修饰ModificationofEnzymeMolecules酶分子修饰什么是酶分子修饰酶分子修饰（enzymemolecularmodification）通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的技术过程酶分子工程（enzymemolecularengineering）指按照酶的各种特性的需要，依据结构－性能间的关系，在分子水平上实现酶的结构设计和操作分子生物学水平：用基因工程方法对DNA或RNA进行分子改造，以获得化学结

2、构更合理的酶蛋白一级结构水平：对天然的酶分子进行改造，包括酶一级结构中氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等?酶分子修饰对酶进行分子修饰的原因和依据在非生理条件下，酶的某些性质不满足工程应用生理最适温度、pH值≠体外最适温度、pH值酶分子对热、酸、碱、有机溶剂的耐受性较差酶在非生理条件下活力下降，抗原性显著理论依据和方法酶的结构特点与酶催化特性的关系：构效关系理性设计（rationaldesign）：找出关键结构，在掌握酶的构效关系的基础上，有目的地对其进行改造半理性设计（semi-ration

3、aldesign）：以基因的随机重组为手段，参考酶的构效关系进行关键位点的改造酶分子修饰酶分子修饰的意义：我们究竟要做什么？应用角度——酶工程提高酶的催化效率，改变底物专一性增强酶的稳定性，降低/消除酶的抗原性研究角度——酶学研究酶分子中一级结构的改变对酶空间构象的影响，进一步探索酶的结构与催化特性之间的关系探测酶活性必需氨基酸的性质和数目探索酶分子的拓扑学及寡聚酶的亚基结合状态探测酶蛋白部分区域的构象状态，以及结构变化与运动探索酶的作用机理和催化反应历程催化特性环境适应性酶分子修饰酶分子修饰的

4、条件修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏维持酶活性功能的必需基团pH值与离子强度决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态修饰反应的温度与时间严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应反应体系中酶与修饰剂的比例控制二者的比例，防止酶的过度修饰而导致的活性完全丧失酶分子修饰酶分子修饰化学修饰的方法学揭示了蛋白质必需基团的化学修饰和活性丧失的定量关系邹氏作图法袁勤生,《现代酶学》p139酶分子修饰化学修饰的方法学酶分子修饰酶分子修饰的种类金属离子置换修饰（重点）大分子结合修饰（重

5、点）侧链基团修饰（重点）亲和修饰肽链有限水解修饰（重点）核苷酸链有限水解修饰氨基酸置换修饰核苷酸置换修饰酶分子的物理修饰酶的定向进化修饰酶分子修饰金属离子置换修饰Metalionsubstitutemodification把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的催化特性发生改变的修饰方法通过修饰了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，阐明催化机制适用对象：金属酶（metalloenzyme）一种结合金属的酶，以一个或几个金属离子作为辅因子金属离子或是直接参与催化作用，或是对保持酶的活性和构象

6、起稳定作用金属酶纯化时仍保留着定量的功能金属离子酶分子修饰金属离子置换修饰常见的金属酶及其离子种类-淀粉酶——Ca2+、Mg2+、Zn2+谷氨酸脱氢酶——Zn2+过氧化氢酶——Fe2+酰基氨基酸酶——Zn2+超氧化物歧化酶——Cu2+、Zn2+细胞色素P450单加氧酶——Fe2+固氮酶——Fe(II)、Mo(IV)谷胱甘肽过氧化物酶——Se(IV)主要的金属离子Ca、Mg、Cu、Zn、Co、Fe、Mn等CytP450酶分子修饰金属离子置换修饰金属离子置换修饰的方法酶的提纯除去原有金属离子加入金

7、属螯合剂，如EDTA等，让酶分子中的金属离子与EDTA形成螯合物透析、超滤或层析除去螯合物加入置换的离子加入含另一种金属离子的溶液，酶蛋白与其结合用透析或层析等方法除去未结合的离子酶分子修饰金属离子置换修饰金属离子置换修饰的作用阐明金属离子对酶催化作用的影响一般在活性中心的金属离子能与底物或辅酶/辅基可逆结合，从而起到催化作用提高酶的催化效率将Zn型-淀粉酶置换成Ca型，活力可提高20%～30%增强酶的稳定性Fe-SOD置换成Mn-SOD后稳定性增强，对NaN3敏感性降低改变酶的动力学特性酰化

8、氨基酸水解酶活性部位的Zn被Co置换后，酶的底物专一性（Km值）和最适pH都显著改变酶分子修饰大分子结合修饰Macromoleculescombinemodification采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生某些精细的改变，从而改变酶催化特性的方法常用的大分子糖、糖的衍生物聚乙二醇（PEG）含C=C双键单体聚合得到的聚合物多肽链，甚至蛋白质酶分子修饰大分子结合修饰大分子结合修饰的方法选择修饰剂选择溶解性好、生物相容性好、抗原性弱、无毒的大分子聚乙二醇（PEG）、寡聚糖