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1、微生物限度检査法一、细菌、霉菌和酵母菌计数1简述细菌、霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及原、辅料受微生物污染程度的方法。也是评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者卫生状况的重要手段和依据。细菌、霉菌和酵母菌计数除另有规定外均釆用平板菌落计数法，这是活菌计数的方法Z一，也是目前国际上常用的i种方法。以琼脂平板上的细菌、霉菌或酵母菌形成的一个独立可见的菌落为计数依据。该法测定结果只反映在规定条件下所牛长的细菌（嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数，不包括•对营养、氧气、温度、pH和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。-个细菌、霉菌或酵母菌的菌落均可山
2、-•个或多个菌细胞生长繁殖而成。因此供试品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单位数（colonyformingunity,cfu）,不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。在进行木法测定时，必须严格按本法所规定的条件操作，以免产生实验误差。2设备、仪器2.1设备2.1.1无菌室微生物限度检查应有单独的无菌室，每个无菌室应有独立的净化空气系统。2.1.1.1结构和要求见无菌检查法2.1.1.2操作间操作间应女装空气除菌过滤层流装置。环境洁净度不应低于10000级局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。操作I'可或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于4.9Pao操作台上备有电子天平
3、，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。2.1.1.3缓冲间缓冲间内应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。缓冲间内不得放置培养箱和其他杂物。2.1.1.4洁净级别及检查方法通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法（参照《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌、和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。洁净级别尘粒数/m3浮游菌（个）/m3沉降菌(个)/(f90mm*0.5h)微粒直径M0・5/pm微粒直径M5ptm100级W3,5OOwOW5wi10000级W35O,OOOW2000W100W3100000级W3,500,000W2O,OOOW500W10沉降菌数测定（II法）无菌
4、室操作台消毒擦拭后,先启动层流净化装置30min,将备妥的营养琼脂平板3个经30〜35°C预培养48h,证明无菌落生长），以无菌方式（或经传递箱）移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30min后将盖盖上。在30〜35°C培养箱内倒置培养48h,取出检查。3个平板牛长的平均菌落数不超过1个。有条件的单位，同时应检查无菌操作间和净化工作台上的浮游菌和尘粒数，分别应达到10000级和100级。如菌落数或尘粒数超标，应清洗过滤系统中的过滤器，必要时予以更换。2.1.1.5在每次操作前、后，用1%苯扎澳钱溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。然后启动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射
5、30mino2.1.2阳性菌试验应另设单独的净化工作台，不得在供试晶检验川的无菌室内或净化工作台上操作。2.1.3无菌室与洗刷、灭菌消毒、培养、结果观察及办公间等配套设施应和对集中，布局合理，避免污染，便于管理。2.2仪器2.2.1恒温培养箱（30〜35°C）、生化培养箱（20〜25°C）、微波炉、匀浆仪（3000〜8000r/min）或康氏振荡器、恒温水浴、电热干燥箱（200〜300°C）、电冰箱、离心机、离心管、0.45um滤膜及薄膜过滤器、蒸汽灭菌器（使用时耍进行牛物指示剂灭菌效果检杳并应定期请有关部门检定）。菌落计数器、显微镜（1500x）、电子天平或天平（感量0.lg）,pll系列
6、比色计。2.2.2.玻璃器皿锥形瓶（250〜300ml,内装玻璃珠若干；500ml,1000ml,）、培养皿（f［径9cm）、量筒（100ml,500ml）＞试管（18mmX180mm、28mmX198mm）及塞、吸管（lml分度0.01,10ml分度0.1）、注射器（20ml或30ml等）、注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）、不锈钢桶（带盖）。玻璃器皿用前应洗涤干净，吸管、量筒不挂水滴，尢残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞入约2cni适宜疏松的棉花，習吸管筒内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加硅胶塞或棉塞，若用振荡器制备混悬液吋，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免振荡时供试液污
7、染瓶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于高压蒸汽121°C灭lW30min,烘干或160°C干热灭菌2h,备用。2.2.3用具大、小橡皮乳头（放丁干净带盖的容器中，并应定期用70%〜75%乙醇溶液浸泡）。无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。接种环（白铁金或银辂合金，环径4〜5mm、长度6〜10cm）、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和
