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1、致病菌PCR检测标准操作程序1目的：保证致病菌PCR检测结果准确、可靠。2适应范围：致病菌PCR定性检测，样木类型为增菌液3试剂、耗材來源：商品试剂盒，PCR专用耗材质控物：ddH20做空白，阴性、阳性对照來源于试剂盒4仪器：BIO-RADT-100PCR仪BIO-RAD电泳装置BIO-RAD凝胶分析成像系统;055010205401020590102生物安全柜(BSC-1300IIA2)0490102；高速离心机(TDL-16G)0470102；1000uL）。微量移液枪（0.5-lOuL>10-20UL>20-200uL、5标准操作:5.1样
2、木的处理：根据国标GB4789系列增菌步骤处理(例如:金葡按GB4789.10-2010)5.2试剂配制0.5XTBE:取10ml50X的TBE加灭菌超纯水稀释至1000ml,摇匀备用。DNA提取、PCR反应体系、上样缓冲液等试剂:均为商品试剂。增菌培养基:配置参照微生物培养基配置记录。5.3、DNA提取（参考DNA提取试剂盒操作标准说明）5.3.1取lml菌液（W2X109个）,10,OOOrpm离心30秒,倒掉上清,收集菌体。5.3.2加入200uL缓冲液RB重悬，10,OOOrpm离心30秒,弃上清。将菌体重悬丁180HL缓冲液RB。5.3
3、.3加入20uL（革兰氏阳性菌120uL）溶菌酶（20mg/ml）颠倒混匀,37°C水浴30分钟,12,00rpm离心2分钟,弃上清，重悬T180nL缓冲液RB中。5.3.4加入20uL蛋白酶K（20mg/ml）溶液,充分混匀,再加入200uL结合液CB,立即漩涡充分混匀，70°C水浴10分钟。5.3.5冷却后加入100HL异丙醇，立即漩涡混匀。5.3.6将上一步混合物转入吸附柱AC中，13,OOOrpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。5.3.7加入500uL抑制物去除液TR,12,OOOrpm离心30秒,弃废液。5.3.8加入700UL漂洗液W
4、B,12,OOOrpm离心30秒，弃废液。5.3.9将吸附柱AC放回空收集管，13,OOOrpm离心2分钟，尽量去除漂洗液，以免影响下游反应。5.3.10取出吸附柱，放入干净离心管小，在吸附膜的小间位置加入100□L洗脱液EB,室温放置35分钟，12,OOOrpm离心lmin,将得到的溶液重新加回吸附柱，12,OOOrpm离心Imino5.3.11得到的DNA溶液4°C保存，若长期保存置于-20°C保存。5.4PCR扩增将得到的样品D"与致病菌PCR试剂盒小引物、Taq酶等按说明书操作,加于PCR反应管，加样在洁净区操作，上机；表1普通PCR反应
5、体系试剂贮备液浓度50从反应体系中加样体积/"10XPCR缓冲液2.5dNTPs2.5mmol/L1.0上游引物20pmol/pL1.0F游引物1.0Taq醜5U/rL0.5DNA模板2.0双蒸水补至50注1：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。注2：每个反应体系应设置两个平行反应。表2PCR反应条件菌类扩增片段长度PCR反应条件预变性变性循环数后延伸沙门氏菌284bp95°C,5min95°C,30s64°C,30s72°C,30s3572°C,5min志贺氏菌629bp95°C,5min95°C,15s65°C,
6、30s72°C,30s3572°C,5min金黄色葡萄球菌132bp94°C,5min94°C,2min57°C,2min72°C,lmin3572°C,7min单增李斯特氏菌274bp95°C,5min95°C,30s55°C,30s3572°C,5min74°C,lmin副溶血性弧菌450bp95°C,5min95°C,lmin60°C,lmin72°C,2min3572°C,5min5.5电泳凝胶制备:称1.5-2g琼脂糖溶丁lOOmlO.5XTBE溶液，煮沸，待冷至60°C左右，加入4uL的GoldView,摇匀，倾入制胶板，冷却待用。点
7、样:将PCR产物5uL与6XLoadingBufferluL混匀,小心加入点样孔。电压5V/cm,设为80VlOOVo时间2040分钟。5.6荧光成像电泳完成后，佩戴PE手套将凝胶置丁•托盘，移于成像处，关闭舱门，脱掉PE手套，点击鼠标，运行试验协议。成像完毕，带上PE手套取出凝胶，置于生物危害待处理区。6结果分析:空白对照、阴性对照无扩增，阳性对照正常检出实验判定有效，反Z判定实验无效。若实验冇效，产物扩出目标条带为阳性，未扩岀为阴性，阳性结果用以下传统方法确证。食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验GB4789.4-2010食品卫生微生
8、物学检验志贺氏菌检验GB/T4789.5-2003食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验GB/T4789.7-2008食品微生物学检验金黄
