山东花生腐霉根腐病病原鉴定

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山东花生腐霉根腐病病原鉴定摘要：利用组织分离技术和选择性培养基纯化技术对山东地区花生腐霉根腐病的病原菌进行了分离和纯化。按照柯赫法则，根据余永年真菌形态学鉴定方法及利用ITS序列比对等分子生物学方法对病原菌进行了鉴定。结果表明，引起山东地区花生腐霉根腐病的病原菌为群结腐霉（PythiummyriotylumDrcchslcr）、旋柄腐霉（Py〃血加Drcchslcr）、畸雌腐霉（Py/加“加irrgMd"Buisman）以及终极腐霉CPythiumultimumTrow）。关键词：花牛；腐霉；根腐病；鉴定IdentificationofPeanutPythiumRootRotPathogeninShandongAbstract：PathogenofpeanutPythiumrootrotpathogeninShandongwasisolatedandpurifiedbytechniquesoftissueisolationandselectivemedia.BasedonKochesrule,thepathogenwasidentified.bythemethodsofFungalmorphologicalandITSsequencealignment.AnditindicatedthatthepathogenofpeanutPythiumrootrotpathogeninShandongwasPythiummyriotylumDrechsler>PythiumhelicoidesDrcchslcr>PythiumirregulareBuismanandPythiumultimumTrow.Keywords:peanut;Pythium;rootrot;identification近年来，随着种植花生经济效益的不断提高，山东省的花生种植面积也在不断增长，目前主要划分的两大优势区域，一是以种植春花生为主的胶东半岛、鲁中和鲁东南地区的29个县；二是以种植夏花生为主的鲁西和鲁西南地区黄河故道的5个县。其小花生腐霉根腐病是影响山东花生产量的主要因素Z-,由于种植而积大，产区集中，连作面积广，给花生生产造成了很大危害。花生根部病害调查分离时，我们从以上大部分地区的花生病株中分离到了腐霉菌（PW加Msp）,为了明确山东省花生腐霉根腐病的病原特征及生物学特性，为防治提供依据，作者于2007-2009年度对山东花生腐霉根腐病病原进行了研究，结果报道如下。1材料与方法1.1症状表现调查方法对山东地区不同花生产区的花生进行出间病害调查并采集发病样本，记录花生从播种到收获是否能受到腐霉的侵染而发病，被害植株是否萎驚，须根的腐烂情况以及初生根、次生根和主根的尖端是否特别容易受害，根系是否完全被破坏[1]O1.2病原菌分离与纯化方法 将从田间采集的病株须根系用H来水冲洗干净，用吸水纸吸干表而的水珠，将病株须根系剪成长5mm的小块，将其放置于VP?选择性培养基中〔2]25°C培养。24h后不断观察，发现有腐霉长出立即转移到CMA培养基上放在25°C恒温箱中培养，纯化，转入CMA斜面培养，5d后菌丝长满，放入4°C冰箱保存备用。1.3病原菌致病性测定方法按照柯赫法则⑶，采用盆栽接种测定方法测定病原菌的致病性，将土壤灭菌后装屁盆，种屁生（屁育22）,花生团棵后，把4°C保存的菌种在CMA培养基上25°C扩繁，长满菌丝后按4%（菌:±）的接种量，与花盆内的土壤混匀，保湿筒保湿48h后调查发病情况，调查持续一周，从病组织分离回接菌种，并作单菌丝培养。1.4病原菌种类鉴定方法1.4.1病原菌最适温度及pH值测定将PDA培养基制成平板。将事先培养好的直径5mm的病菌圆饼转接在平板中央，分别置于4°C、10°C、15°C、20°C、25°C、30°C和35°C进行病原菌最适生长温度测定。在将PDA培养基的pH值调至3-12,按照上述方法将接好菌饼的培养皿置于25°C恒温培养箱内培养，定期观察，记录菌落生长速率以及菌落形态特征。1.4.2病原菌形态观察将腐霉菌在CMA平板培养基上培养，3d后移取边缘菌丝至皮氏（Petri）培养液中，25°C培养1〜3d挑取砲子囊，观察抱子囊形态，有无层出现象，游动抱子的游出方式,并且测量砲子囊大小。待出现藏卵器、雄器、卵抱子后,观察藏卵器、雄器的形态，着生位置，配合情况及卵砲子的形态特征，每项指标分别观察测量100个，并且测量其大小，计算平均值⑷。鉴定则依据抱子囊、藏卵器、雄器、卵孑包子的形态特征，大小及其特性来鉴定，主要参考《中国真菌志》（第六卷，科学出版社，余永年主编）进行鉴定⑴。1.4.3病原菌ITS序列测定将事先用CMA平板培养好的病原菌的菌落刮取下来，利用Biospin植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，而后利用通用引物(ITS1、ITS4)进行PCR扩增，最后利用Biospin胶冋收试剂盒进行冋收并测序⑹。鉴定则参照NCBI(美国国立生物技术信息中心)中的ITS序列，利用DNAstar 等相关软件进行相似序列比对。2结果与分析2.1症状表现出间调查我们发现，鲁东南地区的莒县、莒南县花生根腐病害较为严重；而鲁中地区的宁阳县花生茎腐病和根腐病造成了花生的大面积减产；胶东半岛的招远则以根腐病、白绢病为主；鲁西和鲁西南地区的往平、郵城和济阳苗期主要以茎腐病为主，屮后期则以根腐病为主。2.2分离、纯化出病原菌从莒县、宁阳县、济阳县、在平以及招远等地共采集花生病株145株，利用VP3选择性培养基分离病组织672块，腐霉菌、镰刀菌、色二砲、杂菌出现的频率分别为3&1%、34.7%、21.7%和5.5%,在上述地方采集病根和病土，用黄瓜诱捕的方法分离351块，腐霉菌、镰刀菌、色二孑包、杂菌岀现的频率分别为65.5%、8.8%、24.5%和1.2%。表1VPs培养基分离病原菌比例Table1TheproportionofseparatedpathogenicfungiofVP3地点块数腐霉菌镰刀菌色二砲其它杂菌SiteNumberPythiumFusariumDiplodiaOtherfungi莒县1765573408宁阳226126955济阳131252581在平79243124招远6026925合计67225623314637 表1黄瓜诱捕法分离病原菌比例Table2TheproportionofseparatedpathogenicfungiofCucumberTrapping地点块数腐霉菌镰刀菌色二饱其它朵菌SiteNumberPythiumFusariumDiplodiaOtherfungi莒县103731020宁阳776611济阳10151941在平17170招远53231254合计35123031864从上表1和表2可以看岀腐霉菌的出现频率最高，利用水琼脂培养基对疑似腐霉菌进行了纯化培养，得到纯化培养物。经过病原菌形态观察以及ITS序列测定，初步确定这些病原菌为腐霉（PW加肪7sp）。2.3病原菌的致病性测定随机调查接菌四种不同腐霉的盆栽花生各8株，结果表明，在盆栽接菌群结）窗霉、旋柄腐霉、畸雌腐霉以及终极腐霉3天后，人部分花生衣现岀典型的HI间发病症状，对照植株则生长止常。发病率依次是畸雌腐霉〉群结腐霉〉旋柄腐霉〉终极腐霉（见表3）。通过对病变组织内病原菌的重新分离以及显微观察测量鉴定，新分离病菌与原接种病菌相同，表明这些腐壽菌株为花生的致病菌。表3花生致病性测定Table3Determinationofpathogenicityofpeanutplants菌株采集地接菌种类发病率病悄指数StraincollectionsitesSpeciesofinoculationMorbidityDiseaseindex宁阳P.ultimum81.82%37.66济阳P.myriotyhun88.89%66.67招远P.helicoides83.33%52.38莒县P.irregulare100.00%42.86 2345678■92.4病原菌的种类鉴定结果表明：这些菌株为腐霉菌属的群结腐霉(PythiummyriotylumDrechsler)>旋柄腐霉(PythuunhelicoidesDrechsler)>畸雌腐霉(PythiumirregulareBuisman)以及终极腐霉(PythiumultimumTrow)。试验结果表明：4种腐霉病原菌最适生＜温度介于25°C-30°C之间，低于5°C和高于36°C菌丝牛长缓慢；4种腐霉病原菌最适pH值介于6-7之间。2.4.1不同采集地腐霉形态学鉴定如图图4群结腐霉的形态Fig.4MorphologyofPythiummyriotylum1-2砲子囊3泡囊4-5泡囊破裂产生游动砲子6休止抱子7休止抱子萌发产牛芽管8-9藏卵器、雄器和卵砲了标尺=10pmPythiummyriotylumDrechsler菌落形态：菌落在CMA上无特定形态，菌丝发达,分枝，粗3.9〜9.0pm。泡子囊rfl膨人与不膨人菌丝构成，膨人部分指状或裂瓣状，顶生或间生；游动鞄了肾形，双鞭毛。藏卵器球形或近球形，直径24-31.5（平均28.3）屮m平滑。顶生或间生。雄器棒状或钩状，着生于分枝的雄器柄顶端，与藏卵器接触，每个藏卵器有多个雄器，卵范子球形，直径21-29（平均26.3）gm,平滑，不满器，偶有满器，壁厚1.5—2.0（平均1.76）pm,内含贮物球和折光体各一个。（图4） 图5旋柄腐霉的形态Fig.5MorphologyofPythiumhelicoides1-2砲子囊3胞囊层出4・6藏卵器、雄器和卵抱子标尺=10pmPythiumhelicoidesDrechsler菌落形态：菌落在CMA上呈放射状，气生菌丝棉絮状。菌丝发达，粗3.5〜5.2pm,分枝繁茂。陀子囊梨形、倒卵形，较少近球形,具有一乳突，顶生或间生，近球形砲子囊直径为18.2〜36.7（平均28.6）gm,梨形砲子囊为20.5〜38.2|imxl9〜32.5pm；抱子囊有抱囊层出现象，常常在抱子囊内部层出2〜3层。藏卵器球形，宜径28.6〜43.2（平均37.5）pm,平滑，多数为顶生，少数切生。雄器较大，整个附着在藏卵器上，多橘瓣状，少数棍棒状,少数边缘不规则，卵砲子球形，直径22-32（平均27.8）平滑，不满器。（图5）PythiumirregulareBuisman菌落形态:图6畸雌腐霉的形态Fig・6MorphologyofPythiumirregulare1-2砲子囊3-7藏卵器和雄器8-9卵鞄子标尺=10pm菌落在CMA±呈放射状，菌丝发达，不规则分枝，粗1.8〜7.7|im,抱子囊梨形、柠檬形，或近球形，顶生或间生，12〜 25（平均23.4）|im,藏卵器球形，多间生，偶有*顶生，15~25（平均20）pm,藏卵器壁上常有多个突起。雄器多与藏卵器同丝生，常无柄，卵砲子球形，平滑,单生偶有双生，不满器，11〜22（平均17」）pm,内含贮物球和折光体各一个。（图6）图7终极腐霉的形态Fig<7MorphologyofPythiumultimum1-3菌丝膨大体4-5藏卵器和雄器6卵砲子标尺=10|imPythiumultimumTrow菌落形态：菌落在CMA上呈放射状，菌丝发达，分枝繁茂，粗3.3〜9.8pm,菌丝膨大体近球形，多间生，14〜32（'卜均23.4）（im,藏卵器球形，平滑，多顶生，少间生，直径13〜30（平均20）gm,雄器多紧靠藏卵器形成，受精管明显可见，粗约1.5gm,卵砲子球形，平滑，不满器，10〜25（平均19.2）屮m内含贮物球和折光体各一个。（图7）2.4.2分离腐霉测序结果及同源性比较260.3PythiumrnyriofylumS39.HB-1PythiummyriofyiumGQ121316PythiumTnynotylumZ^ZY-2PythiumhelicoideslS5.ZY-3Pythiumhehcoides^l4.]AY-3PythiumuItimum94Q.JN-3Pythiumirregulare942.JX.-1Pythiumu/fj>nuzn892.JN-2PythiumheEcoides817.NY-2PythiumhehcoidesAB108052Pythiumrnyriotylum327.CP-1Pythiummyriofylum342JY・1PythiumPythiummyriofylum634UY-1PythiumirregLiiareAB107995Pythiumm^riotylum346ZY・1Pythiumhehcoides32l.ZY-4pythiumultimumAB355596250200150100500NucleotideSubstitutions(XI00)图8分离不同地区腐霉菌株基于ITS序列的系统发育树状图Fig.8PhylogenetictreebasedonITSsequencesofPythiumcollectedfromdifferentareas在形态学鉴定的基础上，用Blast对所分离腐霉菌株的ITS序列与GenBank中己有的 ITS序列进行比对，发现大部分腐霉菌株与GenBank中登记的群结腐霉(GQ121316)、旋柄腐霉(AB108052)、畸雌腐霉(AB107995)这3个腐霉种的和似性较高，都在96%以上；少数分离腐霉与终极腐霉(AB355596)的相似性虽然比较低，但遗传距离较其他种要近。本研究未分离、鉴定到其他腐霉种类，分析其原因可能是由于地理区域不同所致。3结论与讨论研究表明，腐霉是花生根部病害的主要致病菌，它能在苗期侵入，破坏植物的根部，降低植物的抗性，为其他致病菌的侵染提供侵入途径和侵染条件，加剧其他病害的发生。其中尤以群结腐霉为重，Ganrcn(1966)和孟宪曾(1982)都曾对其有过相关的报道；而近年来有关终极腐霉和畸雌腐霉能引起根腐病的报道屡见不鲜，但在花生根腐病上还未有深入的研究；旋柄腐霉是在此次研究中发现的新致病腐霉，国内外至今仍未有相关的报道，其致病机理有待于进一步的研究。目前，腐霉种类的鉴定仍以形态学方法为主。分子生物学方法虽然也被广泛应用，但只是作为一种重要的辅助工具用于形态相近或难以区分种类的鉴定。本研究采用了形态学和分子生物学相结合的方法对花生腐霉根腐病的主耍致病菌进行了鉴定，通过分离培养、冋接、再分离以及ITS序列比对表明，群结腐霉(PW加肋myriotylumDrechsler)、旋柄腐霉(PythiumhelicoidesDrechsler)、畸雌腐霉(PythiumirregulareBuisman)以及终极腐霉(PythiumultimumTrow)是山东花生腐霉根腐病的主要病原菌。在生产中我们还发现花生苗期死棵以及后期萎篤在山东地区发生非常普遍，造成了很人的经济损失，凶此如何对花生腐霉根腐病进行有效的防治将是我们今后研究的重点。参考文献：[1]徐秀娟.中国花生病虫草鼠害[M]・中国农业出版社，2008,91〜93.[2]Conway,K・E.SelectivemediumforisolationofPythiumspp.fromsoil[J].PlantDisease・1985,69:393〜395.[3]方中达.植病研究法[M].第3版.北京：中国农业出版社,1998：46〜49；122〜124；139；62.[4]郑小波.疫霉菌及其研究技术[M].北京:中国农业出版社，1997.[5]余永年.中国真菌志[M].第六卷.霜霉/北京：科学出版社，1998：1〜139.[6]马国忠，余永年•凝胶电泳与腐霉属的分类[J].真菌学报，1991,10(3)：217〜222.