SOD的分离纯化与活性鉴定

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1、铜锌SOD的分离纯化与活性鉴定【实验导读】蛋口质的提取分离技术是化学牛物序研究者应该熟练掌握的重点技术之一。蛋白质的纯化步骤应根据纯化蛋白的具体性质来设计。可以利用到的性质包括蛋白质的分了量人小、蛋白质的等电点、对冇机溶剂的耐受性、对温度的耐受性、中性无机盐对蛋白质溶解性的影响等等。为了保证蛋白质提取分离纯化的成功，需耍在整个实验过程中，对所得蛋白质的总量和活性进行不断监测。SOD是超氧化物歧化酶的简称，是一个典型的腮类蛋白质。它催化超氧化物的歧化反应，是真核生物细胞内抗氧化酶系的重耍组成部分。它能够耐受相对较高的温度、对有机溶剂丙酮和氯仿-乙醇也具有较好的耐受性。利用这些

2、性质，木实验通过一些列实验流程达到了对大蒜SOD进行初步纯化的目的。每经过一个纯化步骤，本实验都将监测所得产物的总蛋白量以及总SOD活性，并计算SODiW在总蛋白屮的比活力(总SOD活性与总蛋白量之比)。如果分离纯化过程是成功的，则总蛋白量应不断下降，而SOD酶的比活力应不断上升。通过本实验的训练，读者应该能够初步掌握蛋口质的纯化流程，根据所给蛋白质的理化性质设计出一•套比较合理的蛋口质纯化方案。一、实验目的1.进一步熟悉掌握分光光度计的使用方.2.熟悉SOD提収与分离的基本原理与操作方法，学习一般蛋白质纯化的基本流程.3.掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋口质含量的基本原理与操作

3、.4.了解SOD活力测定一邻苯三酚法的原理.二、基本原理对于以氧气作为呼吸作用最终电子受体的生物来说，除将氧气还原为其完全还原产物水以外，还有可能产牛包括超氧负离子(0Q在内的一系列不完全还原产物，这类分子统称为活性氧族(reactiveoxygenspecies,ROS)。ROS具有极强的化学反应活性，「】J以与蛋白质、脂类、核酸等生物人分了发生反应并破坏它们的结构与生物学功能。ROS在细胞内聚集将对细胞的正常住命活动造成不良后果。为了应对这一潜在的严峻挑战，细胞内形成了一套有效的ROS清除系统。超氧化物歧化K(superoxidedismutase,SOD)是细胞内RO

4、S清除系统的重要组分Z-oSOD广泛存在于动植物及微生物体内，可催化细胞内超氧负离了(01)的歧化反应，将02转化为山02和0“因此，SOD具有强烈的抗氧化活性，在化妆品、食品、医药等领域具有十分广阔的应用両景。本实验介绍的是一种SOD初步纯化方法。SOD是一种多聚体金属蛋白，根据酶活性中心所盂金属辅某的不同，可将SOD进一步分为Fe-SOD、Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Ni-S0D4种，这四种不同的SOD分别由不同的基因编码。无论是在原核还是真核牛•物当中，SOD基因的表达都处于体内外各种因素的严密调控之下。原核生物SOD基因的表达调控主要受其生长营养条件以及所处坏

5、境的影响。而在真核生物细胞内，SOD基因的表达调控则与动植物的生长发冇阶段与体内各种激素水平有关⑷。Cu/Zn-SOD主要存在于真核住物与细菌的细胞质中。在细菌、植物和动物屮，Cu/Zn-SOD的编码基因序列保守性较低，这可能与不同生物适应环境的机制不尽相同有XoMn-SOD主要存在于原核生物和真核生物的线粒体中。FeSOD存在于原核生物和少数植物中，在原核生物和植物叶绿体屮编码l^e-SOD的基因序列相似性很高⑵。Ni-SOD的发现则相对较晚，主要存在于一些低等生物中，在植物中尚没有被发现⑶。天然存在的这些SOD,虽然活性屮心所需的金属离子不同，但催化活性部位却具有高度的

6、结构同一性和进化的保守性。即活性小心金属离子都是与3到4个组氨酸(His)残基的咪喘基(血-SOD含1个天门冬氨酸竣基配位)呈畸变的四方锥或扭曲的四面体配位。三种SOD的主要性质比较见下表。三种SOD的主要理化性质比较Cu/Zn-SODMn-SODFe-SOD分子结构一或四聚体一或四聚体一或四聚体分子量32000,6500042000,8500042000,85000每个亚棊金属含量1Cu:1Zn0.5~lMn0.5~lFe颜色蓝绿色紫红色黄褐色特征吸收峰260nm,680nm280nm,475nm280nm分子构象主要为B-折叠主要为«-螺旋主要为a-螺旋抑制剂CN、II

7、202氯仿-乙醇氯仿■乙醇、H202Cu/Zn-SOD是分布最广而且是最重要的SOD,主要存在于真核细胞的细胞浆内，分子量约为32KD,通常情况下由两个亚基组成。Cu/Zn-SOD对热、pH以及某些比较极端的理化因素具有有较强的耐受性。比如，即使经60°C短时间处理后酶的活性几乎无损失；同时，酶活性不受冇机溶剂乙醇和氯仿影响。大蒜蒜瓣内含冇较丰富的Cu/ZnSOD,通过组织破碎后,可溶解于PH7.8磷酸缓冲液中。由于该酚不溶于丙酮,可用丙酮将其沉淀析IIIoCu/Zn-SOD对氯仿-乙醇混合液不敏感，即使用这种混合