生化酶学教材

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1、高低。根据酶促反应进程曲线，采用合理的方法进行的酶活性浓度测定，原理科学、方法简便、灵敏度高、成本低、应用广泛。(一)酶活性浓度的表示方法酶活性用活性单位表示，常用的酶活性单位有惯用单位、国际单位和Katal单位。1．惯用单位20世纪50年代以前常用首先报告某种酶测定方法的临床酶学家的名字来命名该酶的活性单位，如测定AMY的Somogyi单位，转氨酶的Karmen单位等。酶不同，惯用单位就不同，即使同一种酶也因测定方法不同而有数种活性单位，应用不便，现已少用。2．国际单位1963年国际酶学委员会

2、推荐采用国际单位来统一表示酶活性的大小，即在25℃及其他最适条件下，每分钟催化1微摩尔底物转化成产物所需要的酶量为一个国际单位。1965年将温度改为30℃，1972年又取消了对温度的规定。到1976年对酶活性单位的定义为：在特定的条件下，1分钟内转变1微摩尔底物的酶量为一个国际单位，以IU表示，即1IU=1μmol／min。由于未指定反应温度，目前省略国际二字，即常将IU简写为U。3．Katal单位1979年国际生化协会为了使酶活性单位与国际单位制(SI)的反应速率相一致，推荐用Katal单位(

3、也称催量，简写为Kat)。即在规定条件下，每秒钟催化1摩尔底物转化所需的酶量，1katal=1mol／s。我国法定计量单位制中的酶催化活性单位为katal，其对血清中酶量而言显然过大，故常用单位为μkatal或nkatal。1katal=60×106U，1U=1μmol／min=16.67nmol／s=16.67nkatal。4．酶活性浓度单位临床上测定的不是酶的绝对量而是浓度。酶活性浓度以单位体积所含的酶活性单位数表示。常用U／L来表示体液中酶催化浓度，也可用katal/L报告酶活性浓度。(二

4、)酶促反应进程酶促反应体系中，底物浓度[S]和产物浓度[P]随着反应的进行不断发生变化。如将酶反应过程中测得的[P]或[S]变化量对时间作图，可得酶促反应时间进程曲线(图4-1)。该曲线反映了酶促反应进程中主要成分的变化规律，也可以从中得到酶促反应的速度。图中[P]或[S]变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。典型的酶促反应过程一般包括三个时期，即延滞期、线性期和非线性期。1．延滞期延滞期(lagphase)是指反应开始的一段时间，此时[S]开始下降，随之有相应[P]逐渐增加。但由于多种因素的影响

5、，该期酶促反应速度比较慢。不同反应的延滞期长短不等，可以从几秒到几分钟。单一酶促反应的延滞期是从反应开始至达到最大反应速度所需要的时间。期间发生的变化包括酶活性中心的形成与催化位点的暴露、酶与辅酶因子的结合、底物的解离、底物与酶的结合等。酶偶联反应的延滞期较长，除了以上过程之外，还包括中间产物的积聚、指示反应速度增加、指示反应速度与待测酶的酶促反应速度达到平衡所需的时间。因此，辅助酶越多延滞期就越长，通常为1～3分钟。2．线性期线性期(linearphase)是指延滞期后酶促反应速度达到最大反应

6、速度并保持相对恒定的一段时期，此时有过量底物存在，时间进程曲线呈直线或接近直线状态。因线性期底物量足够，酶促反应速率不受底物浓度的影响，产物[P]和底物[S]变化与t成直线关系，因此测定此时的酶促反应速率就能较好地反映酶活性的大小。不过线性期是一个相对的概念，试剂中底物用量不可能大到完全不限制酶活性发挥的程度，而且底物量随着反应进行而不断消耗。一般认为，当底物消耗量小于5％，不足以明显改变反应速度时，仍认为酶促反应以初速度即最大速度进行。在选定条件下，标本中酶浓度越高，其线性期就越短。在实际工作

7、中往往需要根据酶促反应动力学曲线，来设定线性期和非线性期的界限。3．非线性期非线性期(non-inearphase)又称底物耗尽期，是指线性期后反应速率明显下降、酶促反应进程曲线偏离直线的一段时期。随着反应的进行，底物浓度不断下降，产物浓度不断上升，使反应体系中逆反应增加；反应产物的抑制作用、酶的热失活、酶的聚合或解离等也会增加，这些原因会使酶促反应变慢。在这段时期酶促反应速度受底物浓度的影响较大，产物[P]和底物[S]变化与时间t之间不成直线关系。可见，只有依据酶促反应进程曲线中线性期的反应速

8、率才能准确计算出反应体系中的酶活性浓度。因此，不论采用哪种酶活性浓度测定方法，都应该尽量保证在线性期进行检测，如果在延滞期或非线性反应期检测势必造成较大的误差。二、酶活性测定方法按照检测时段的不同，酶活性测定方法可分为定时法和连续监测法两大类。(一)定时法定时法(flxedtimeassay)指测定酶促反应过程中某一段时间内底物的消耗量或产物的生成量，计算出该时段内的平均反应速度，再换算成μmol／min，以此代表待测酶的活性浓度。该法一般是在反应一开始即计时，到达设定时间时加入终止剂(强酸、强