增强型绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达【开题报告】

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1、毕业论文开题报告生物技术增强型绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达一、选题的背景与意义随着生命科学和医学研究的不断深入，研究者们迫切需要一种能够在活体中表达且易于检测的报告基因，目前常用的报告基因主要有分泌型胎盘磷酸酯酶(secretedembryoalkalinephosphatase，SEAP)基因、β-半乳糖苷酶(galactosidase)基因、β-葡糖苷酸酶(glucosidase，GUS)基因、萤火虫荧光素酶(luciferase，LUC)基因等，但这些基因的检测方法并不理想，它们都需要底物和辅

2、助因子，因而在活体中的应用受到限制。而绿色荧光蛋白基因作为一类新型的报告基因，它在蓝光或长紫外光的激发下，不需要任何反应底物及其他辅助因子就能发出绿色荧光。作为报告基因，GFP是能在活细胞中表达的发光蛋白；作为荧光标记分子，GFP既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害。而且新的研究表明，GFP是一个良好的细胞间信号传递的动态标记分子,可以跟踪观测第二信使。增强型绿色荧光蛋白(EGFP)是GFP的一个突变体，发出的荧光强度要比GFP大六倍以上，且EGFP具有敏感的标记检测率，又无放射性的危害，比GFP更

3、适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体定位和转运等。目前，在利用一些原核表达载体进行基因表达研究，常常遇到外源基因表达与否不能迅速得知，纯化过程中对各分离组分需进行多次电泳检测，才能进行后续工作，花费大量时间。因此，构建以绿色荧光蛋白为标记的原核表达载体能够为外源基因表达的检测提供一种简单而直观的方法。本课题旨在利用增强型绿色荧光蛋白为标记构建一个可以直观地观察蛋白表达情况的原核表达载体pET-28a-EGFP，并了解该载体的表达情况，探索其作为报告基因在以后研究中应用的可能性

4、。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：基本内容：（1）设计引物，通过PCR法扩增EGFP目的片段；（2）将EGFP目的片段与pMD19T-Vector连接，构建pMD19-EGFP载体；（3）将pMD19-EGFP与pET-28a双酶切，回收大小片段之后连接，构建pET-28a-EGFP载体；（4）将pET-28a-EGFP重组载体转化至大肠杆菌，获得转EGFP基因的大肠杆菌；（5）IPTG诱导，并在诱导不同时间观察转EGFP基因大肠杆菌中绿色荧光蛋白的表达量。解决的主要问题：（1）EGFP目的片段的克

5、隆；（2）pMD19-EGFP载体的构建；（1）pET-28a-EGFP重组载体的构建；（2）转EGFP基因的大肠杆菌的获得及原核表达条件的研究。三、研究的方法与技术路线：研究的方法：（1）根据EGFP序列特征设计一对引物FEGFP和REGFP，分别含有NdeI和EcoRI酶切位点，通过PCR扩增EGFP目的片段。（2）将EGFP片段与与pMD19T-Vector连接，转化至大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，PCR扩增及鉴定之后，用质粒小量抽提试剂盒制备pMD19-EGFP质粒DNA。（3）将pMD19-E

6、GFP与pET-28a用NdeI、EcoRⅠ同时进行双酶切，回收大、小片段，之后连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并鉴定，鉴定完毕后用质粒小量抽提试剂盒抽提pET-28a-EGFP质粒。（4）将重组载体pET-28a-EGFP转化至大肠杆菌BL21，筛选阳性克隆PCR扩增及鉴定。将转EGFP基因的大肠杆菌接种于LB液体培养基中，经IPTG诱导表达，在诱导的0h，1h，2h，3h，4h，5h收集诱导表达的菌体，并置于长波紫外线下照射，观察细胞中绿色荧光蛋白的表达量。研究技术路线：pMD19-EGFP质

7、粒的抽提pMD19-EGFP质粒的双酶切回收小片段（750bp）PCR扩增EGFP序列pMD19-T与EGFP的连接转化至大肠杆菌DH5α阳性克隆的筛选及鉴定引物设计与合成pET-28a质粒的抽提pET-28a质粒的双酶切回收大片段大小片段的连接转化至大肠杆菌DH5α重组质粒的抽提阳性克隆的筛选及鉴定转化至大肠杆菌BL21转EGFP大肠杆菌表达条件研究四、研究的总体安排与进度：（1）2010年5、6月根据EGFP序列特征设计引物，引物由上海生物工程公司合成，以pFGC-EGFP为模板，通过PCR法扩增EG

8、FP目的片段并进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。（2）2010年7、8月用胶回收试剂盒回收目的基因片段，与pMD19T-Vector连接，转化至大肠杆菌DH5α中，筛选阳性克隆，进行PCR扩增及鉴定。将转化菌液进行扩大培养，用质粒小量抽提试剂盒制备pMD19-EGFP质粒DNA。（3）2010年9、10月将质粒pMD19-EGFP与pET-28a同时进行双酶切，回收大、小片段并连接，将连接好的载体转化至大肠杆菌DH5α中，筛选阳