课题3　血红蛋白的提取和分离

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1、血红蛋白的提取和分离一、基础知识分析与教学建议（一）凝胶色谱法知识要点：1.凝胶色谱法的用途；2.凝胶色谱法分离蛋白质的原理。教学建议：教师在介绍凝胶色谱法的基本原理时，可以结合教科书提供的插图，让学生对凝胶色谱法分离蛋白质的过程有一个直观的认识。（二）缓冲溶液知识要点：1.缓冲溶液的组成和作用机理；2.熟悉一般缓冲溶液的配制方法；3．缓冲溶液广泛应用于生化实验、微生物的培养、组织切片和细菌染色以及酶的研究等方面。教学建议：教师首先可以结合生活中的一些缓冲现象，让学生充分理解缓冲溶液的重要性。在进行本课题的实验操作之前，可以让学生查阅相关资料，练习一些常用缓冲液的配制。[来

2、源:学§科§网]（三）电泳知识要点：1.电泳的基本原理；2.不同类型的电泳。[来源:学#科#网]教学建议：电泳技术广泛应用于生化实验，在分离分析酶、蛋白质、核酸等生物大分子方面具有较高的分辨率。教师可以通过一个简单的实验使学生理解电泳现象，比如在盛有红褐色Fe(OH)3胶体的U形管的两个管口，各插入一个电极。通直流电后，发现阴极附近的颜色逐渐变深，阳极附近的颜色逐渐变浅。这表明Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，在电场作用下向阴极移动。这种在外加电场作用下，带电粒子发生迁移的现象就叫做电泳。教科书中用楷体字简单地介绍了聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理，教师可以结合资料，开拓学生的知

3、识面，围绕聚丙烯酰胺凝胶电泳，介绍其他类型的电泳原理及应用。本实验的选做部分是通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳对血红蛋白进行纯度的鉴定，同时也可以测定血红蛋白亚基的分子量。此外，还可以通过聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳来测定天然蛋白的分子量；通过聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳来测定蛋白的等电点；等等。相关原理可以查阅生物化学技术的有关书籍。使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测出未知蛋白的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出

4、售。二、实验安排及注意事项（一）第1课时完成基础知识的教学。教师需要用简单直观、通俗易懂的方式讲解凝胶色谱法和电泳的基本原理。教师可以根据学生的接受情况，适当增加一些相关知识的教学，加深对本课题的理解。第1课时还要学习缓冲溶液的配制。本课题所用的缓冲液是20mmol/L的pH7.0的磷酸缓冲液。在pH5.8～8.0的缓冲范围内，磷酸缓冲液的配制方法见下表。配制前需要准备0.2mol/L的Na2HPO4溶液和0.2mol/L的NaH2PO4溶液。Na2HPO4溶液的配制方法：将71.64g的Na2HPO4·12H2O溶解在1000mL的蒸馏水中。NaH2PO4溶液的配制方法：

5、将31.21g的NaH2PO4·2H2O溶解在1000mL的蒸馏水中。pH0.2mol/LNaH2PO4/mL0.2mol/LNaH2PO4/mLpH0.2mol/LNaH2PO4/mL0.2mol/L[来源:学_科_网Z_X_X_K]NaH2PO4/mL5.86.06.26.46.66.88.012.318.526.537.549.092.087.781.573.562.551.07.07.27.47.67.88.061.072.081.087.091.594.739.028.019.013.08.55.3（二）第2课时进行凝胶色谱柱的制备。教材中已经详细地介绍了凝胶色谱

6、柱的制作，教师可根据学生小组的数目，课前准备好所需的材料。值得一提的是，凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果，但是直径过大会造成洗脱液体积增大，样品的稀释度过大，因此应选择直径不超过2cm的色谱柱。凝胶色谱柱的高度与分离度有关，一般不超过1m。在装填凝胶前，一定要按教材描述的方法将凝胶充分溶胀，溶胀时可以用蒸馏水，也可以用洗脱缓冲液。如果发现凝胶的表面不平，可以用玻璃棒将表面的凝胶轻轻搅起，让其自然沉淀至表面平整。凝胶装填完毕一定要充分洗涤平衡，可以平衡过夜，但切记不得发生洗脱液流干、露出凝胶颗粒的现象，否则凝胶色谱柱需要重新装填。（三）第3课时进行样品的处理。教师可以在课

7、前从学校附近的屠宰场索取新鲜的猪血，切记要在采血容器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠。取血回来后，马上进行离心。血红蛋白溶液在透析袋中可以透析过夜。建议教师第2课时和第3课时在同一天进行，这样可使凝胶色谱柱的平衡和血红蛋白溶液的透析同时进行。（四）第4课时进行血红蛋白的提取。此步骤是本课题的关键，每一步操作都要按照教科书的要求进行。加样前可以在样品中加入质量分数为1%的葡萄糖或蔗糖（糖不会干扰分离效果），以调节样品的比重，使之稍大于洗脱液，从而缩短加样时间。如果样品出现浑浊、有沉淀，可以离心或过滤后再加样。在实验过程中，