酶的分离与纯化ppt课件.ppt

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1、第四章酶的分离与纯化一、酶的分离二、酶的精制三、电泳四、酶的浓缩五、酶结晶一般程序1.预处理和固液分离：加速固液相分离2.细胞破碎分离胞内产物3.初步纯化（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质4.高度纯化（精致）：除去与产物性质相似的杂质5.产品加工一、酶的分离（一）发酵液预处理目的：改变发酵液物理性质尽可能使产物转入便于后处理的某一相中去除部分杂质1、发酵液的相对纯化（1）无机离子的去除Ca2+常用草酸Mg2+三聚磷酸钠，生成可溶性络合物Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na+Fe3+黄血盐[K4Fe(CN)6],形成普鲁(Fe4[Fe(CN)6]3)沉淀3K4Fe

2、(CN)6+4Fe3+=Fe4[Fe(CN)6]3+12K+(2)杂蛋白质的去除1）沉淀法机理主要是破坏电荷。酸性溶液中与一些阴离子如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸等形成沉淀。碱性溶液中与一些阳离子如Ag2+Cu2+Zn2+Fe3+Pb2+等形成沉淀2）变性法蛋白质因变性导致溶解度下降而被除去。常见的如加热、大幅度调pH、加有机溶剂和表面活性剂等。3）凝聚和絮凝用Al2(SO4)3等凝聚剂使蛋白质胶体体系不稳定，通过相互碰撞发生凝集。形成的颗粒较细。絮凝作用是指在某些高分子絮凝剂（如聚丙烯酰胺类衍生物）的架桥作用下将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。形成的颗粒较粗，用量小，速度快

3、。4)吸附法(3)色素及其他物质的去除活性炭：0.1-1.5%离子交换树脂如DEAE-纤维素从含酶溶剂中吸附色素物质时，可同时去除非活性蛋白质2、发酵液的固-液分离离心和过滤菌种对过滤速度影响很大真菌容易过滤，放线菌则难培养基组成对过滤也有影响（二）细胞破碎1、细胞壁与细胞破碎2、细胞破碎的方法1）机械法：珠磨法（beadmill）实验室：Mickle捣碎机；中试：胶质膜处理；工业：高速珠磨机高压匀浆法：大规模细胞破碎方法；对于酵母等难破碎及高浓度细胞可采用多次循环方法；丝状真菌、较小的G+菌，含有包含体（Inclusionbody）的基因工程菌不宜用此法。超声波法（Ultrasonica

4、tion）：杆菌比球菌容易破碎；G-比G+容易破碎；酵母菌不易破碎；实验室较常用的方法，样品温度？？2）非机械法：酶法、化学法、物理法化学渗透法（chemicalpermeation）：改变细胞壁或细胞膜的通透性；TritonX-100：结合、溶解磷脂，破坏膜脂双层；EDTA：对G-菌外膜有破坏作用；有机溶剂：分解细胞壁中的脂类；变性剂：脲、盐酸胍与水中氢键作用。优点：选择性，易于固液分离。缺点：通用性差，效率低，毒性JJ-2组织捣碎匀浆机ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机（三）酶的提取（extraction）1、盐溶液提取：盐溶（saltingin）在低浓度盐溶液中，酶的溶解度增加。常用稀盐溶

5、液（0.02-0.5mol/L）。2、酸、碱溶液提取3、有机溶剂提取（四）离心分离1、离心机种类(1)常速离心机最大转速≤8000r/min,相对离心力（RCF)≤1×104g(2)高速离心机1×104r/min≤转速≤2.6×104r/min,8×103g≤RCF≤1×105g(3)超速离心机转速≥2.5×104r/min,RCF≥1×105gTGL-16M高速台式冷冻离心机2、离心分离方法（1）差速离心(differentialcentrifugation)（2）密度梯度离心(densitygradientcentrifugation)（3）等密度梯度离心(sendimentation

6、equilibriumcentrifugation)3、离心条件（1）离心力相对离心力RCF=[1.12×10-5×rn2]×g（2）离心时间（3）温度和pH离心条件沉淀的亚细胞成分1,000×g5min真核细胞4,000×g10min叶绿体真核细胞碎片细胞核15,000×g20min线粒体细菌30,000×g30min溶酶体细菌菌体碎片100,000×g180min核糖体多聚核糖体用差速离心法分离亚细胞成分（五）沉淀分离1、盐析法盐溶(saltingin)在低浓度盐溶液中，酶的溶解度增加。盐析(saltingout)盐浓度升高到一定程度，蛋白质和酶浓度随盐浓度的升高而不同程度下降并沉淀析

7、出。（1）盐析法的机制（2）盐析用中性盐的选择常用的中性盐：MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4和NaH2PO4（3）(NH4)2SO4饱和度表示法（4）影响盐析的因素1）蛋白质浓度2）pH和温度的影响蛋白质的盐析盐析应用最广泛的是硫酸铵优点1）溶解度大25℃时硫酸铵的溶解度可达4.1mol/L(541g/L)以上。大约每升水可溶解767g之多。在这一高溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以被盐析沉淀出来。2）温度系