酶的分离纯化课件.ppt

《酶的分离纯化课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、TheExtraction,SeparationandPurificationofEnzyme酶的分离纯化1酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎酶提取酶分离纯化酶浓缩酶干燥、贮存动物、植物或微生物细胞发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。2酶的组合分离纯化策略Resolution（分辨率）Speed（速度）Capacity（容量）Recovery（回收率）设计分离纯化工艺的基本要求3酶分离纯化的基本原则酶液的储存以及所有操作都必须在低温条件下进行酶蛋白作为两性电解质，其结构受pH值的影响酶和其他蛋白质一样，易在溶液表面和

2、界面处形成薄膜而变性，因此尽量减少泡沫的形成重金属离子可能引起酶的实效，有必要加螯合剂微生物污染及蛋白酶的存在都能是酶被降解破坏酶蛋白溶液浓度低，酶经常迅速失活，可能是玻璃容器的表面效应使得蛋白质变性4酶的纯化过程，约可分为三个阶段：(1)粗蛋白质(crudeprotein):采样→均质打破细胞→抽出全蛋白，多使用盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。(2)部分纯化(partiallypurified):初步的纯化，使用各钟柱层析法。(3)均质酶(homogeneous):目标酶的进一步精制纯化，1、酶分离纯化不同阶段52、细胞破碎许多酶存在于细胞内。为

3、了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎JY92-IID超声波细胞粉碎机细胞破碎珠高压细胞破碎机DY89-I型电动玻璃匀浆机6机械破碎捣碎法研磨法匀浆法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到

4、破坏，而达到细胞破碎3、细胞破碎方法及其原理7酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。4、酶的提取8盐提取（改变离子强度）基本原理（盐溶和盐析）向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：1)盐溶（saltingin）：低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解

5、度。大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。9在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。2)盐析（saltingout）：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。10原因：高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。11B、有机溶剂沉淀（降低介电常数）利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。1.沉淀机理降低溶液的介电常数部分地

6、引起蛋白质脱水2.常用有机溶剂丙酮乙醇甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。12有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低13优缺点：优点：1）分辨率比盐析法高2）沉淀不需脱盐3）溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点：1）容易引起蛋白质变性失活2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。145.酶的纯化与精制根据酶分子大小和形状的分离方法1）离心分离152）凝胶过滤FLASH163）透析与超滤17超滤原理的示意图18根据酶分子电荷性质的分离方法1）离子交换层析定义：利用离子交换树脂作为支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分

7、离的方法。分类:阳离子交换树脂,活性基团是酸性的,如羧甲基纤维素等，阴离子交换树脂，活性基团是碱性的,如二乙基氨基乙基纤维素19FLASH202）电泳带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。213）等电聚焦电泳224、利用生物分子专一性结合的分离方法定义：利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力23原理：把待纯化的某一蛋白质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到像琼脂糖凝胶一类表面的功能基，当蛋白质混合物加到填有亲和介质的层析柱时，待纯化的某一蛋白质则被吸附在含配体的琼脂糖颗粒表面上时，而其它的蛋白质则因对该配体无特异的结合部位而

8、不被吸附，它们通过洗涤可除去，被特异结合蛋白质可用含