《酶的分离纯化》PPT课件.ppt

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1、第二章酶的分离纯化第二章酶的分离纯化知识点:1.酶活性测定2.酶溶液制备3.酶分离纯化的基本过程4.根据分子大小轻重建立的分离纯化方法5.调节溶解度的分离方法6.按电荷的正负性设计的分离方法7.根据亲和作用建立的纯化方法8.根据稳定性的差异建立的分离纯化方法9.蛋白质(酶)的高效液相色谱分离分析法学习目标和要求:1.掌握酶活性测定和酶溶液制备方法.2.掌握根据分子大小轻重建立的分离纯化方法和按电荷的正负性设计的分离方法及.根据亲和作用建立的纯化方法3.熟悉酶分离纯化的基本过程4.了解调节溶解度的分离方法、根据亲和作用建立的纯化方法、.根据稳定性的差异建立的分离纯化方法及.蛋白质

2、(酶)的高效液相色谱分离分析法酶的分离提纯包括三个基本环节：一是抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；二是纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；三是制剂，即将酶制成各种剂型。根据酶本身的特性，在分离纯化工作中必须注意下列问题:(1)要注意防止酶的变性失活.(2)酶的分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能的除去，因此，在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈”的手段。此外，由于酶和它的底物、抑制剂等具有亲和性，当这些物质存在时．酶的理化性质和稳定性发生了一定变化，从而提供了更多条件和方法可供采用。(3)酶具有催化活性。检测酶活性，跟踪酶的来龙去脉，为选择适当方

3、法和条件提供直接依据。在工作过程中，从原料开始每步都必须检测酶活性．一个好的方法和措施会使酶的纯度提高倍数大，活力回收高，同时重复性好。1酶活性测定酶活力(EnzymeActivity)也称酶活性，履指酶催化一定化学反应的能力.酶活性是研究酶的特性、分离纯化以及酶制剂生产和应用时的一项不可缺少的指标。酶活力是用在一定条件下，它所催化某一反应的反应初速度来表示。酶反应速度(指初速度)可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示.其单位为mol/s。1.1酶的活力单位1.2摩尔催化活性分子活性和转化率(催化中心活力)mol催化活性(MolarCatalyticActi

4、vity)表示在单位时间内，酶分子中每个活性中心转换的分子数目。根据米氏方程：Vmax=Ko[E]Ko=Vmax/[E]Ko即为转换率(也用Kcat表示),如果每一个酶分子只有一个催化中心,那么催化中心活性等于摩尔催化活性.如果一个酶分子有几个催化中心,那么催化中心活性等于摩尔催化活性除以n.每种酶的转换率不同.下表列出了几种酶的转换率:1.3比活力比活力(性)(SpecificActivity)是酶纯度的量度，即指：单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用IU/mg蛋白质来表示。一般来说，酶的比活力越高，酶越纯.1.4酶活力的测定方法酶活力与底物浓度、酶浓度、pH、温度

5、、激活剂、抑制剂的浓度以及缓冲液的种类和浓度都密切相关。酶活性测定可用终止反应法或连续反应法。1.4.1终止反应法(StoppedMethod)终止反应法是将酶反应按时间即刻完全停止，取出反应物或产物，予以分离，再确定反府物的消耗量，或产物的形成量，算出酶活性。产物的测定方法可用酶法、化学法或放射化学法。使酶停止作用常用强酸、强碱、三氯乙酸或过氯酸，也可用SDS）使酶失活或加热使酶变性等。（1）酶法酶法是用其他纯酶将产物直接或间接转变成一个可用分光光谱仪或荧光光谱仪测定的化合物。通常采用偶联法，例如葡萄糖氧化酶催化的下列反应：葡萄糖+O2→葡萄糖内脂+H2O2欲测定葡萄糖内脂和

6、H2O2均较困难，可在该反应中加入过氧化物酶和木酚，使发生下列反应:由于4—甲氧联酚在435nm波长处有光吸收峰，因此、只要测定A435，就可知4—甲氧联酚的量，可得H202的量，从而可推知酶活力。在这种方法中，偶联酶(过氧化物酶)必须过量，否则，将出现下图的情况。一般偶联酶量最少也应在5倍以上。偶联法中偶联酶对反应速度的影响再如：测定己糖激酶（或葡萄糖激酶）：葡萄糖＋ATP→葡萄糖-6-P其偶联-指示剂为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶葡萄糖-6-P+NADP+→6-P-葡萄糖酸+NADPH+H+这时即可测定340nm处光吸收的增加得到己糖激酶（或葡萄糖激酶）的活性.酶偶联测定法可用分

7、开的也可用连续的反应系统进行.(2)化学法化学法是利用化学反应使产物转变成一个可用某种物理方法测出NH3和CO2，然后用比色法、滴定法、气体体积量度法等方法测出酶活性.化学分析法的优点是:不需要特殊仪器,一般有恒温水浴、滴定管、离心机及比色计或分光光度计即可进行工作。对于绝大多数的酶，都可根据底物及产物的化学性质，设计具体的测定方法，应用范围较广。缺点是：由于测定结果是根据间隔一定时间取样所得，取样过多，则总的工作量较大，取样过少，则不能得到酶反应过程的全貌，并且在实际操作过程中，取样及停止