组织灌流固定技术.doc

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1、动物灌注固定一、准备1、手术器械一套（可不高压消毒）、针头2、试剂瓶三个，烧杯一个，漏斗、磁力搅拌子一个3、所有进入老鼠体内的液体都要过滤二、方法1、提前配制4％多聚甲醛（称量4g，放置于100ml0.1MPB中，55度加热搅拌至充分溶解，搅拌子速度从低到高，慢慢增加，滤纸过滤，4度保存）、温生理盐水或PBS（滤纸过滤，40ml/只或快速滴5min，流出液变白即可，盐水过多细胞死亡多）；2、装好多聚甲醛、温生理盐水吊瓶，排空气泡，确保一定液体压力。10％水合氯醛麻醉（20g小鼠约0.2ml；大鼠：10％0.3ml/100g;4％1ml

2、/100g;7％0.5ml/100g），反向固定好老鼠；3、沿腹腔打开老鼠的胸腔，充分显露心脏（插针）和肝脏（判断），尽可能多暴露心脏，利于操作，进液。充分完全暴露心脏和右房是关键4、找到鼠心尖，用止血钳（选把好的很关键）预夹住心尖少部，持针从心尖略偏左下进，插入有突破感即停（小鼠室壁厚约1mm），打开生理盐水的输液器。大鼠直接进到主动脉内。钳夹心尖，针向左刺是技术关键进针深度5、若正确进入，右房充盈，剪破右房，此时液体较快下滴（调整针头朝向），红色血液从右房流出，快速冲尽全身血液（否则影响免疫反应），时间约4－5min，40ml/只

3、小鼠，80ml/只大鼠。（取水冲洗切口，防血液凝固）正确进入指标：右房充盈（但不是迅速充盈－此示针进右房），肝脏逐渐变白，口鼻干燥4、换4％多聚甲醛灌注30min左右。多聚甲醛要偏快。100ml/只小鼠，200ml/只大鼠用灌注机：先排空管中空气，再行灌注灌注正确标准：换多聚甲醛后身体反应，尤其尾巴竖起、四肢伸直变硬。5、取脑组织，正确脑变白，无红色血管。继续后固定12h，沉糖切片。如不立即切片，可保存高压灭菌PB中。注意：1、心脏很脆，尽量一次成功，不要反复卡紧——松开，心脏破了就失败了。2、进针偏右，进到右室：肺水肿；进针太深，进

4、到左房：左房大，肺水肿取材：一、准备：1、提取蛋白：碾磨器、EP管、培养皿、细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、组织冻存管（高压，标记）、一次性手套、口罩、冰盆2、提取核酸：见前面二、方法：3、鼠内脏：心、肝、脾、胰腺、肾、肾上腺、睾丸－卵巢（雌鼠Y形上端；雄鼠Y形下方）、胸腺、膀胱4、鼠脑：皮质、海马、纹状体、小脑、下丘脑、垂体、脑室周围区、脊髓一半全脑