口腔生物学课件_5口腔细胞培养及其应用.doc

《口腔生物学课件_5口腔细胞培养及其应用.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、口腔细胞培养及其应用细胞培养：模拟体内的生理环境，在适当的条件下，使活体组织细胞在体外环境存活、生长增殖，并维持其结构功能。贴壁型细胞：必须贴附于支持物表面才能生长。大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞潜伏期（游离期，贴壁期）对数生长期停止期（平台期）潜伏期：　　细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。　　初代培养细胞贴附

2、慢，可长达10～24小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，10～30分钟即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附。另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维连接素，细胞表面蛋白等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细胞膜的表面，有的则来自培养基中的血清。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。超净台滤器压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广电热干燥箱：干热消毒（160℃，2小时）。主要用干玻璃器皿消毒滤器：过

3、滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌超净工作台：为细胞操作提供无菌环境紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染合成培养基合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成

4、的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。血清中含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子；③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分无血清培

5、养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而

6、减少冰晶对细胞的损伤。冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。原代培养取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。传代培养细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。功能特点分泌功能矿化功能收缩功能附着能力再生能力增

7、殖分化影响因素生长因子胰岛素纤维粘连蛋白抗坏血酸羟基磷灰石二、唾液腺细胞细胞形态特点腺泡上皮细胞导管上皮细胞肌上皮细胞免疫组织化学染色腺泡上皮细胞：角蛋白、淀粉酶、对氨基水杨酸、导管上皮膜、前角蛋白、单克隆角蛋白、分泌成分阳性反应导管上皮细胞：角蛋白、上皮膜蛋白、磷酸酐酶抗体染色阳性反应肌上皮细胞：肌动蛋白、S－100蛋白、肌凝蛋白抗体染色阳性反应功能特点分泌功能腺泡细胞：淀粉酶、PRP、唾液过氧化物酶、特异蛋白等腺泡上皮细胞：顶端分泌、基底及侧膜分泌导管细胞：胶原肌上皮细胞：胶原唾液腺细胞的增殖分化基

8、底潜能干细胞理论单细胞全能干细胞理论双细胞亚全能干细胞理论增殖分化功能影响因素细胞因子激素细胞外基质钙离子三、口腔粘膜细胞培养方法组织块法酶消化法细胞形态特点免疫组织化学染色波形丝蛋白表达阴性多种角蛋白表达阳性功能分泌：胶原蛋白和非胶原蛋白金属蛋白酶四、颌骨相关的硬组织细胞分散组织机械分离法消化分离法培养细胞的纯化人工纯化（酶消化法，机械刮除法，反复贴壁法，克隆法等）自然纯化细胞的冻存与复苏所谓冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在