细胞培养技术和培养箱.ppt

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1、第十章细胞培养技术和培养箱cellcultureandincubate教学基本要求123掌握细胞培养概念、细胞培养箱分类、基本原理和基本结构。熟悉细胞培养技术。了解细胞培养箱常见故障处理及仪器的进展本章目录第一节细胞培养技术的基本原理第二节培养细胞的类型、特点及增殖过程第三节培养细胞的生存条件及技术方法第四节培养箱的分类、结构、使用及维护保养第五节培养箱的进展第一节细胞培养技术的基本原理细胞培养（cellculture）也称为组织培养（tissueculture），是从生物体内取出组织或细胞，在试管和培养平皿内模拟体内生理环境，于无菌、适当温度和一定营养条件下

2、，对这些组织或细胞进行孵育培养，使之保持一定的结构和功能，以便于我们观察研究。第二节培养细胞的类型、特点及增殖过程根据体外培养细胞能否贴附在支持物上生长的特性，可分为贴附型和悬浮型两大类。大多数培养细胞为贴附型，多呈上皮样或成纤维细胞样，具有接触抑制和密度抑制的特性。少数细胞在培养时以悬浮状态生长（包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞，以及一些肿瘤细胞）。第二节培养细胞的类型、特点及增殖过程贴附细胞型MRC-5成纤维细胞第二节培养细胞的类型、特点及增殖过程贴附型细胞正常猴肾单层上皮细胞Molt4细胞悬浮2～3天的细胞图片(成人T淋巴细胞白血病细

3、胞株)第二节培养细胞的类型、特点及增殖过程第二节培养细胞的类型、特点及增殖过程悬浮型培养细胞第二节培养细胞的类型、特点及增殖过程传代（passage或subculture）当细胞增殖至一定密度后，由于培养细胞的孤立生存环境和有限的营养，则需分离出一部分细胞接种到其他容器，并及时更新培养液，使细胞增殖继续过程。一代从细胞接种到下一次传代再培养的一段时间。细胞培养一代的过程中，一般细胞可倍增2～6次。第二节培养细胞的类型、特点及增殖过程原代细胞培养从供体取得组织，分离得到所需细胞后接种于培养瓶，进行首次培养。次代细胞培养将原代细胞培养物用胰酶和EDTA消化处理后，

4、收集洗涤，再分装至含有新鲜营养液的培养瓶中继续培养，形成的单层细胞。第二节培养细胞的类型、特点及增殖过程细胞系（cellline）原代细胞一经传代后细胞。无限细胞系或连续细胞系细胞获得永生性即永久增殖的能力。培养细胞的生存条件培养皿或培养瓶温度、湿度和气体由CO2恒温孵育箱提供生长培养液10％～20％的血清维持培养液2％～5％的血清营养物质糖、氨基酸、维生素、无机离子、微量元素等第三节培养细胞的生存条件及技术方法培养设备第三节培养细胞的生存条件及技术方法技术方法细胞分离原代（初代）培养消化法传代组织块剪切,消化法使组织进一步分散制备获得细胞悬液计数后，加入营养

5、液稀释成一定浓度细胞悬液孵箱中进行培养细胞悬液计数后，加入营养液稀释成一定浓度细胞悬液孵箱中进行培养将原代细胞培养物用胰酶和EDTA消化处理后，收集洗涤，再分装至含有新鲜营养液的培养瓶中继续培养第三节培养细胞的生存条件及技术方法第三节培养细胞的生存条件及技术方法冻存选用对数生长期细胞，用常规方法收集按（1～5）×106/ml细胞浓度，悬浮于含10％DMSO或甘油的含血清培养液中，分装，封口，放入纱布小袋中。可用手工方法从把冻存管悬在液氮容器口开始，在30～40min时间内，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。或先将冻存管移入液氮罐口颈部气相中过夜

6、，次日将纱布袋缓慢下降至液氮中，历时3min。在液氮中可长期保存。复苏将冻存于液氮中的冻存管取出，迅速放入37℃～40℃水浴中使其在1min内融化。在无菌条件下打开冻存管，取出细胞悬液至离心管中，补加10ml培养液，500～1000rpm低速离心5min，去上清，加入新鲜培养液适量，转入培养瓶中置37℃培养。细胞的冻存和复苏-“慢冻快融”第三节培养细胞的生存条件及技术方法霉菌污染后，一般肉眼可见在培养液中形成白色或浅黄色飘浮物，短期内培养液多不混浊；倒置显微镜下可见于细胞之间悬浮飘荡在培养液中的纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝，很多菌丝在高倍镜下可见到有链

7、状排列的菌珠；或可见散在细胞周边和细胞之间的卵圆形单细胞真菌。细胞培养微生物污染的检测第三节培养细胞的生存条件及技术方法细菌污染后，由于大量酸性物质产生，培养液短期内颜色变黄并出现明显混浊现象；倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量细小的圆球状颗粒飘浮，有时在细胞表面和周围有大量细菌存在，细胞生长停止并有中毒表现。支原体污染可做如下检测：①相差显微镜检测，将细胞接种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察，支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间；②荧光染色法，用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst33258使支原体DNA着色，置荧

8、光显微镜下观察，可见散在于细胞周围或附