修订版-2脲酶样品的含量测定.ppt

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1、酶（蛋白质）工程实验二——脲酶的蛋白质含量测定云南大学生命科学学院生物技术专业系统实验（四）指导老师：陈慧诚（138-8809-8105）李彩霞（158-8782-6613）主要内容一、实验目的二、基本原理三、仪器试剂四、实验步骤五、结果计算六、思考与讨论一、实验目的了解酶液样品中蛋白质浓度测定的基本原理和技术方法。学会用考马斯亮蓝G-250结合法测定酶液样品中的蛋白质浓度。蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种方法，即凯式定氮法，双缩脲法（Biuret法）、Folin

2、－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝-G250法（Bradford法）。其中,Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。凯式定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以凯式定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。四种方法并不是在任何条件下都能适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都有其优缺点。在选择方法时应考虑以下方面：①实验对测定

3、所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费时间。Bradford法法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg/ml，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。Bradford法的突出优点是：1.灵敏度高:据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光

4、吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。2.测定快速、简便:只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。3.干扰物质少:如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙

5、酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如TritonX―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。缺点：1.由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用γ-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。2.仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸

6、干扰Lowary法一样）。3.标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。二、基本原理2.1测定酶液样品中蛋白质浓度的意义知道酶含量的多少，指导酶的研究、生产、改造和应用。与酶活力测定结果联合，计算酶的比活力，用于评价酶样品的纯度和活力大小。2.2考马斯亮蓝G-250结合法测定蛋白质含量的基本原理又称为Bradford法，由Bradford在1976年建立。考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中能与蛋白质的疏水区（多为碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基侧链）相结合。考马

7、斯亮蓝G-250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm。在一定范围内（10~100μg/ml），考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度A595与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。三、仪器试剂3.1设备与耗材漩涡混合器试管、吸管、容量瓶、量筒移液器、移液器吸头分光光度计电子分析天平计时器3.2试剂磷酸盐缓冲液：0.2MpH7.0的磷酸盐缓冲液100mL。标准蛋白溶液：10mg/ml牛血清白蛋白（Bovin

8、eSerumAlbumin,BSA）溶液，准确称取BSA1g，用上述磷酸盐缓冲液溶解并稀释至100ml。待测酶样品液：实验一测定酶活性后剩余的酶液。无水乙醇。磷酸（即市售的质量百分浓度为85%的磷酸，比重为1.69）。考马斯亮蓝染液：0.01%考马斯亮蓝G250溶液，准确称取0.01g考马斯亮蓝G250，加入5ml无水乙醇中，充分振荡混匀后，再加入10ml磷酸，然后加蒸馏水定容到100