碱裂解法抽提质粒的原理.doc

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1、碱裂解法抽提质粒的原理SDS碱裂解法制备质粒DNA的原理：细菌悬浮液暴露于高pH的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被十二烷基硫酸盐包盖，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效沉淀下来，离心去除后，就可从上清液中回收质粒DNA。1．试剂（1）溶液Ⅰ：Tris-HCL（pH8.0）25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L,溶菌酶（临用时加）5mg/ml（2）溶液Ⅱ（新鲜配制）：NaOH0.2mol/L,SDS1﹪(W/V)（3）溶液Ⅲ（100ml）：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.

2、5ml(pH4.8),水28.5ml（4）酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）（5）无水乙醇和70﹪乙醇（6）无DNA酶的胰RNA酶（7）TE2．实验流程（1）挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养，用无菌牙签或挑种环挑取单菌落于20ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，于37℃剧烈震摇下培养过夜。（2）将1.2ml培养物倒入微量离心管中，于4℃以5000g离心5分钟（两次），将剩余的培养物贮存于4℃。（3）吸取并弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。（4）将细菌沉淀重悬于100μl溶液Ⅰ中，剧烈振荡。注：溶菌酶促使大肠杆菌细胞变得脆弱而易于裂解。溶菌酶对反应液的pH有很大的依赖关系，当

3、其低于8.0时，细胞裂解的效果就大为逊色。因此，溶液Ⅰ不仅使用了Tris-HCL缓冲体系，同时好加入了适量的葡萄糖而有利于pH的调节。乙二胺四乙酸（EDTA）因其是二价金属离子（如Mg2＋等）的螯合剂，故少量地存在便可抑制核酸酶的活性，从而保护质粒DNA免被降解。（5）加200μl溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。确保离心管的整个表面均与溶液Ⅱ接触。注意不要振荡。将离心管放置于冰上5分钟。注精选范本,供参考！：SDS的作用在于使细胞裂解，以释放出质粒及染色体的DNA。在高pH（12.0-12.5）的反应体系中，则会使线性缺口的质粒DNA以及线性的染色体DNA片段

4、被选择性地变性，而共价闭合环状的质粒DNA则不会受影响（注意：如果pH超过了12.5时，朝螺旋闭合环状DNA亦会发生不可逆的变性效应）。但在此种条件下，蛋白质同样也会发生变性，从而减轻了核酸酶对质粒DNA的降解作用的可能性。若把反应管在65℃水浴中保温一段时间，会进一步加强染色体DNA的变性作用，得到清亮的裂解液。（6）加150μl溶液Ⅲ，盖紧管口，将管倒置，温和振荡20秒，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上5分钟。注：pH4.8的醋酸钾溶液降低了反应混合物中的pH，起到中和作用，从而使线形的质粒及染色体DNA复性，并聚集成不可溶的网络状聚合物。同时高浓度的醋

5、酸钾亦会引起蛋白质-SDS复合物和高分子质量的RNA分子发生沉淀，而共价闭合环状的质粒DNA分子则仍然以天然的状态保存在溶液中。这样通过离心处理，便可把网络状的DNA聚合物同变性的蛋白质-DNA等以复合物形式沉淀出来，从而使质粒DNA得到纯化。（7）4℃，12000g离心5分钟，将上清液转移另一离心管中。（8）加等体积酚-氯仿-异戊醇，振荡混匀。（9）4℃，12000g离心5分钟，将上清液转移到另一离心管中。（10）用两倍体积的无水乙醇于室温沉淀质粒DNA，振荡混匀，于室温放置两分钟。（11）4℃，12000g离心5分钟。小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出

6、。再将附于管壁的液滴除尽。（12）用1ml70﹪乙醇溶液洗涤沉淀，4℃，12000g离心5分钟，弃去上清液，在空气中使核酸沉淀干燥。（13）用50μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE重新溶解核酸，振荡，贮存于-20℃。【本文档内容可以自由复制内容或自由编辑修改内容期待你的好评和关注，我们将会做得更好】精选范本,供参考！