分子生物学常用技术.ppt

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1、第二十二章常用分子生物学技术的原理及应用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication第一节分子杂交与印迹技术MolecularHybridization&BlottingTechnology核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹

2、技术的原理复性RNADNA（一）印迹技术（二）探针技术探针(probe)一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹技术(Southernblotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。（二）RNA印迹技术(Northernblotting)用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。WesternBlotting方法一直接法：优点：1.快速（

3、一种抗体）2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带缺点：1.免疫反应性降低2.无信号二级放大3.抗体标记费时昂贵WesternBlotting方法二间接法：优点：1.信号放大，2.灵敏度高（多个二抗结合位点）3.多种标记的二抗可供选择4.免疫特异性不受标记影响5.可选择不同的Marker缺点：1.有交叉反应引起的非特异性条带2.额外的二抗孵育以及条件优化YYHRPHRPHRPSuperSignal®底物与二抗HRP反应发光5SuperSignal®HRP标记二抗与一抗－蛋白复合物结合42漂洗和封闭1电泳分离，转膜，固定蛋白于膜上3一抗与蛋白结合(小鼠单抗或

4、兔多抗)间接WesternBlotting操作流程:其他斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)DNA点阵(DNAarray)DNA芯片技术(DNAchip)第二节聚合酶链反应PolymeraseChainReaction5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555一、基本工作原理目录Cycle3555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以

5、上。目录模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+二、PCR体系基本组成成分三、PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）基因突变分析四、PCR的主要用途三、几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术实时PCR技术原理目录三、DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳

6、或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。DNA自动测序结果举例目录基因文库GeneLibrary第四节基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)基因文库(genelibrary)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。基因组DNA文库目录第六节遗传修饰动物模型的建立及应用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalMod

7、el转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。转基因——被导入的目的基因转基因动物(transgenicanimal)——目的基因的受体动物一、转基因技术目录核转移技术即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(clone)。二、核转移技术基因剔除技术也称基因靶向(genetargeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。三、基因剔除技术四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用建立动物模型①单基因决定疾病模型基因剔除获得性突变(ga

8、in-of-functionmutation)②多基因决定疾病模型第七节生物芯片