共聚焦课件2010.ppt

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1、兰州大学医学实验中心激光共聚焦显微镜及其在生物医学研究中的应用近年来,激光共聚焦显微镜在医学和生物学研究方面的应用越来越广泛，它成像清晰、精确、客观，大有淘汰普通光学显微镜和荧光显微镜的趋势。因此，作为医学工作者，了解和应用这种仪器亦是大势所趋。显微镜成像清晰度的决定因素:1.分辨率2.球差3.色差1、分辨率：指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用显微镜所能分辨清楚最近的相邻两点间的距离来表示。人眼及各类显微镜的分辨率人眼分辨率：0.20mm光学显微镜分辨率：0.25mm共焦显微镜分辨率：0.18mm电子显微镜分辨率：0.20nm2、球差：

2、是由于透镜不能把近轴光线和远轴光线在光轴上共聚焦，以至透过标本一点的光线，在通过透镜时不能聚焦成一点,而是形成一个光斑,从而使成像模糊不清。3、色差：是由于显微镜透镜类似于三棱镜,对不同颜色的光线具有不同的折射率。所以光线透过透镜后,不同色的光聚焦在不同点上,从而使成像模糊,而且像的边缘尚带有色晕。共聚焦显微镜的原理简介（ConfocalLaserScanMicroscopeCLSM）从某种意义上讲，共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜，它对传统的光镜从以下几方面作了改进在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置，共扼聚焦装置和检测系统而形成的新型显微镜。利

3、用共聚焦光路和激光扫描获得生物样品的显微断层图象，动态扫描记录、图像处理及三维立体构建、成份分析等软件。原理简介硬件：激光源共聚焦显微镜步近器检测器光电倍增管计算机图象输出设备（显示器彩色打印机）。软件：显微镜自动控制和扫描系统、图像处理和分析系统共聚焦扫描显微镜的系统组成激光共聚焦显微镜构成激光器光电倍增管检测器显微镜步近器计算机电子图像软件共聚焦显微镜的特点光源共聚焦技术点扫描技术信号放大电子图像软件1、光源用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强、光源波束集中、波长相同。2、采用了共扼聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个小孔，将焦平面以

4、外的杂散光挡住，消除了球差。共扼聚焦原理图激光器扩光器样品滤光片针孔检测器入射光发射光长通滤光片入射光发射光长通滤光片激光器扩光器样品滤光片针孔检测器入射光发射光长通滤光片激光器扩光器样品滤光片针孔检测器普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别3、点与面扫描技术共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源）逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合，最后得到一个整体平面的或立体的像。普通光镜：是在可见光源下一次性成像。Z通过精细平面光切，形成生物样品不同平面的精细图象，将一个连续的光切图象Z轴重叠就可形成一个完整的三维图

5、象4、图像信号及处理：光电倍增管放大信号，计算机采集和处理光信号。计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像，得到的图象是数字化的，可以在电脑中进行处理，再一次提高图象的清晰度。共聚焦显微镜的应用高清晰成像半定量荧光强度分析荧光探针表达量测定分层扫描多种荧光标记同时检测荧光标记物绝对定量分析扩展应用高清晰成像激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制，减少了成像的干扰，以及使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可达普通光学显微镜的1.4倍。可以清晰的表现某些细微结构。牛肺动脉内皮细胞，微管高清晰成像牛肺动脉内皮细胞，微管高清晰成像鼠成纤维细胞单克隆

6、anti–β-tubulin标记高清晰成像检测人类癌细胞表皮生长因子高清晰成像涡虫纲扁虫肌动蛋白丝鬼笔环肽高清晰成像培养的293细胞绿色荧光蛋白高清晰成像培养的人肝癌细胞哑叮橙染色高清晰成像透射光扫描（DIC）利用激光透射扫描成像，用特殊滤光片达到相差显微镜的效果，可获得清晰的具有立体感的图片树突状细胞培养细胞半定量荧光强度分析荧光信号通过光电倍增管转化为电信号，经过电脑分析可对荧光信号进行相对定量测定。细胞中特异性荧光标记的蛋白在不同药物环境和不同培养时间条件下的表达差异。荧光探针的特异性标记：即荧光强度与特异性标记蛋白的表达量成正相关。随机选择细胞

7、或区域，测定其荧光强度值，并进行统计分析。半定量荧光强度分析随机圈取细胞可得到所圈细胞的相对荧光强度值半定量荧光强度分析获得数据的TXT文件将TXT文件导入EXCEL进行统计分析荧光表达量测定利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组间荧光标记蛋白表达的差异。荧光表达量测定分层扫描（切片扫描）按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小，可控制样品扫描层面的厚度。即样品中相当薄的一层被探测到，而其他层面不影响成像。分层扫描（切片扫描）当观测较厚样品时，普通透射光不能透过样品，则可以通过切片扫描检测荧光的方法来观测。入射光被检测层面整个样品白光（不能透过）发

8、射光分层扫描（切片扫描）较厚层面较薄层面人血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。分