病毒滴度测定.doc

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1、病毒滴度测定有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。1．VP（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位）2．GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似）3．PFU（空斑形成单位）4．TCID50（50%组织培养感染剂量）不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。1．测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病毒颗粒。用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷

2、性病毒颗粒。因此这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。2．GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。如果重组腺病毒含有报告基因如GFP或LacZ等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。3．PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复，即使在同一实验室内，不同技术员操作也很

3、少能得到相同的结果。4．TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE。TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定。所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。许多因素如加入的病毒储存液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会影响结果。最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。一种是用更小体积的病毒液进行感染并在感染过程中不断晃动培养板（Mittereoler等，19

4、96）；另一种方法则在感染时将培养板进行离心（1000RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997）。这两个实验室所得到的结果更为稳定，并证实以前的方法低估了病毒保存液中感染性病毒颗粒的数量。迄今为止，尚无一种方法被控制机构认定为测定滴度的标准方法。对于同一管病毒保存液，不同的方法所得到的结果往往相差100倍以上，典型的数据见表6。所有结果都只是大概的，目前最有效的生物学方法（离心法感染）能检测到1个感染性颗粒/2个颗粒。下一部分，我们将详细描述3种不同的测定病毒滴度的方法。选择滴定方法要考虑的关键因素包括可重复性、稳定性、敏感性、易用性和

5、耗时。无论选择那种方法，稀释和滴定过程必须重复操作以得到精确结果。一般来说，用TCID50方法得到的病毒保存液的滴度应为：106~107第一代细胞经冻融后108~109100倍数量的细胞经过冻融后1010~1011用氯化铯方法纯化后表6：各滴度测定方法特性方法类型时间可重复性滴度*评注VP物理学方法2小时好5×1012GTU生物学方法2天可变2×1011PFU生物学方法21天变化很大5×1010传统方法TCID50生物学方法10天可变2.5×1011昆腾公司标准方法以VP法测得的5×1012的病毒保存液为标准5.8.1O.D.260nm（VP/ml）这种

6、方法只是通过DNA量来表示病毒滴度。相关系数为1.1×1012/OD260单位。由于大多数分光光度计在OD值小于0.1时不够精确，而样品准备过程中又至少要稀释10倍，因此如果OD值大于0.1，我们可以估计病毒量大于1012。这一方法只可用于测定氯化铯纯化后溶于缓冲液中的病毒，因含血清培养基会干扰吸光度。同时，它也要求病毒浓度足够高，并且不含缺陷性颗粒。1．4℃融化病毒保存液。2．在无菌超净台内用病毒裂解液（VLB）（0.1%SDS，10mMTrisPH7.4，1mMEDTH）准备二个病毒稀释度。最小需要量为：s病毒裂解液病毒稀释度52ul52ul1：2（

7、稀释液1）168ul42ul1：5（稀释液2）注意：病毒滴度高时（1013/ml）用1：10和1：20稀释度，滴度低时用低稀释度，保证OD值在0.1~1.0之间。3．56℃震荡培养10分钟。0uf'gbjf4．准备1ml含有VLB和透析缓冲液的空白对照溶液，比例同上，以缓冲液代替病毒裂解液。5．测定260nm处吸光值：稀释液1再稀释1：5，为稀释液3。稀释液2再稀释1：5和1：10，分别为稀释液4和稀释液5。测定稀释液5（2次）、4、3的OD260，取此4值的平均值作为最终结果。例如1．将450ulVLB和50ul稀释液即透析缓冲液加入比色杯中。2．记下

8、空白管读数后弃去，不要冲洗。3．加入450ulVLB和50ul1：5稀释样本（稀