IBDV主要结构蛋白VP2、VP1原核表达及其ELISA抗体检测试剂盒的研发.pdf

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1、硕古学ｔｔ论文化ＤＶ主要结构蛋白ＶＰ２、ＶＰｌ原核表达及其ＥＵＳＡ抗体检测Ｎ试剂盒的研发，—？－．＂＇一－；一ｙ．一＇＇，心，．．乂＇批Ｖ－心：山；／？－－－？？＇．１／（．－：ｒ｝，．…＂：Ｍ＼．：ｆ■．‘－？，一、Ｖ／－．／．‘－１．＇？’‘＇‘，．乂乂．．刘婷背，．．；布辞慕婦巧；ｉ＇‘悼．，岩；巧：起劈巧．节察罩疆聲＾Ｗ攀攀廣亦乂聲屬薩；ｉｉ議分类号Ｓ％８．３１密级公开ＵＤＣ硕±学位论文ＩＢＤ

2、Ｖ主要结构蛋白ＶＰ２、ＶＰ１原核表达及其ＥＬＩＳ乂抗体检测试剂盒的研发刘婷学科专业预防兽医学指导教师韦平教授论文答辩日期２０１６年５月２５日学位授予日期２０１６年６月３０日答辩委员会主席何秀苗教授广西大学学位论文原创性和使用授权声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得。的研究成果除己特别加标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大一学或其它单位的学位而使用过的材料。与我同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均己在论文中作了明确说

3、明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归。目属广西大学本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，Ｐ：学校有权保存并向国家有关部口或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可Ｗ将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可Ｗ采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于；□保密，在年解密后适用授权。不保密。＂＂请在上相应方框内打Ｖ（）论文作者签名：方日期：ｆｃ２ｏｌｔ年同８曰指导教师签名；日期２〇ｔ＾巧＆曰ｌ坪作者联系电话：电子邮箱：抵ＤＶ主要

4、结构蛋白ＶＰ２、ＶＰｌ原核表达及其ＥＬＩＳＡ抗体检测试剂盒的硏发摘要传染性法氏囊病（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅ化Ｄ）是由传染性法氏囊病，一病毒（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅｖｉｍｓ旧ＤＶ）引起的、高度接触性，种急性，还，疾病，除了直接导致临床发病之外可引起感染鸡的免疫抑制使机体对其他病原体的易感性增加，继发感染其他病原，给养殖业造成了巨大的经济损失。间接ＥＬＩＳＡ是目前检测巧ＤＶ抗体方法中应用最广泛的血清学，方法，具有特异性强和敏感性高的特点且易操作、设备简单。本课题使－ＶＰ１用

5、原核表达系统表达了旭ＤＶ的主要结构基因，并ＷＶＰ２、ＶＰ１和ＶＰ２Ｈ个重组蛋白作为包被抗原建立了相应的间接ＥＬＩＳＡ方法，期望为生产上旧ＤＶ抗体的检测一、基因工程疫苗的研发提供种可靠的检测手段。首先利用ＰＣ民技术扩增了旧ＤＶ分离株ＮＮ１１７２的ＶＰ２和ＶＰ１基因，预测并筛选了ＶＰ２和ＶＰ１基因中抗原性、表位可能性和亲水性较好的重要区段－，通过同尾酶法获得ＶＰ２ＶＰ１串联基因把３个基因的扩增产物；然后－－Ｔ－３２ａ＼ＶＰ２ＥＴ、Ｚ＼ＶＰｌＥＴ分别连接到原核表达载体ｐＥ，构建了Ｚｐｐ和／＼－ＶＰ２－ＶＰｌＥＴＨ个重组体ｐ，测序验证后把重组质粒

6、转入大肠杆菌ＢＬ２１，经ＳＤＳ－ＩＰＴＧ诱导优化表达，表达产物经ＰＡＧＥ分析，证实得到分子量分别为－６９ｋＤａ、１１４ｋＤａ和６３ｋＤａ的ＶＰ２、ＶＰ１和ＶＰ２ＶＰ１重组蛋白；经粗纯化Ｎ－及ｉＮＴＡ亲和层析纯化后获得纯度较高的重组蛋白ｎｂｉｏ也ｎ；Ｗｅｓｔｅｒｇ分析表明－ＶＰ１重组蛋白均可与旧ＤＶ的特，ＶＰ２、ＶＰ１、和ＶＰ２异性抗体发生反应。，说明重组蛋白具有良好的反应原性－ＶＰ纯化的ＶＰ２、ＶＰ１和ＶＰ２１重组蛋白作为包被抗原，建立了相应－ＥＬＩＳＡＶＰ２－ＥＬＩＳＡＶＰ１ＥＬＩＳＡ的间接抗体检测试剂盒即、和－ＶＰ２ＶＰ－

7、１ＥＬＩＳＡ。分别检测旧Ｖ、ＲｅｏＶ、ＡＬＶ和ＮＤＶ阳性血清，结果均，表明建立的间接ＥＬＩＳＡ具有高度的特异性为阴性；进行重复性试验，批Ｉ？？６内变异系数在２．２％．９％之间，批间变异系数在２．８％１４％之间，表明建立的方法具有良好的重复性；应用建立的间接ＥＬＩＳＡ检测分别免疫了旧Ｄ灭活疫苗、旧Ｄ基因工程疫苗和旧Ｄ弱毒疫苗的商业鸡场的免疫血清共５７０份，结果能显示疫苗免疫后机体抗体水平的变化趋势；用建立的间接ＥＬＩＳＡＷ及商品试剂盒Ａ、Ｂ平行检测ＯＤ４５０在间接ＥＬＩＳＡ临界值附近的１８４份－ＥＬＩＳＡ的相对敏感性血清样品，结果显