细胞培养技术 教学课件 作者 兰容 周珍辉 主编 章静波 主审 实验部分5鸡胚成纤维细胞的原代培养.ppt

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1、实验五鸡胚成纤维细胞的原代培养一、实验目的1．掌握单层细胞培养法（组织消化培养法）培养细胞的基本方法和操作过程。2．进一步练习动物细胞培养过程中的无菌技术。3．初步掌握在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。二、实验原理所有组织中都有一定量的细胞间质（纤维和基质等），对细胞生长有妨碍作用（妨碍营养物质的穿透），用胰酶消化能除去间质，使组织松散成单个细胞或小的细胞团，细胞易于生长。三、器材超净工作台、二氧化碳培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、酒精灯、吸管、培养瓶和盖、解剖剪、眼科剪、烧杯、镊子（尖头、圆头和弯头）、离心管和盖、离心机、血球记数板、100目不锈钢筛网、青

2、霉素瓶和盖、培养皿、水浴锅实验结束后注意清洗用过的实验器材，为下周实验做准备。下周实验所需器材清洗、包装好后交给第四组同学在下周三时灭菌。四、试剂和材料Hanks液75％酒精（用于浸泡金属器械）0.25％胰蛋白酶DMEM培养液(含小牛血清及青、链霉素)鸡胚：孵化10天的受精蛋五、操作1、取材取孵化10天的鸡蛋，用75％酒精消毒弹壳，小心取出鸡胚，放于无菌培养皿中，用解剖剪或解剖刀除去头部，然后用弯头眼科镊夹起腹部皮肤，剪开腹腔和胸腔除去内脏。2、漂洗和剪切将胚体放入另一培养皿中，用Hanks液清洗3次去除血污，切成几小块，然后转移到无菌青霉素瓶中，在青霉素小瓶内用眼科剪反

3、复剪成1mm3的小块。3、消化加入适量0.25％胰蛋白酶溶液，一般每个鸡胚加2mL消化液，盖好橡皮塞，置37℃水浴中消化20～30min，消化时每隔5min摇动一次，使组织块散开。视组织块变得疏松，颜色略变白时，从水浴中取出，在超净工作台中用吸管轻轻吸去消化液，加入2～3mL含小牛血清的培养液，以终止消化。然后用吸管反复吹打，使大部分组织块分散成单细胞状态，静置片刻，让未被消化完的组织自然下沉，然后将上层液通过100目不锈钢筛网，制备细胞悬液。将细胞悬液移入无菌离心管中备用。4、离心和计数离心（800r/min,10min），弃去上清液，加入适量培养液，用吸管轻轻吹打混匀

4、后取样计数。根据计数结果用培养液调整细胞浓度为1×106个/mL。5、接种培养每瓶培养瓶接种4mL细胞悬液，再添加6mL培养液，轻轻混匀后，盖紧瓶塞，标上细胞名称，组号和接种日期等，置37℃、5％CO2培养箱中开放培养（旋松培养瓶盖）。6、观察每天要对接种培养的细胞做常规性检查，观察的主要内容是：污染与否、细胞生长状态、PH（通过培养液颜色变化），如发现培养液变为黄色且又混浊，表明已被污染，这时细胞不易贴壁生长，逐渐死亡。如培养液为桔红色，一般说明细胞生长状态良好。在没有发生污染的情况下，一般按规24h，可见到许多细胞贴壁，由圆形悬浮状态的细胞延展成短梭状，随着培养时间的

5、增加，逐渐呈现出具有长突起的梭形、星形或三角形的细胞形态。由于细胞生长旺盛，代谢产物堆积，CO2增多，培养液逐渐变酸呈黄色，但液体澄清，此时换液一次。一般每2～3天换液1次。细胞计数培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。一般用血球计数板计数。每个大方格的体积为0.1mm3计数板（25X16）的结构及测定原理菌悬液浓度＝【25*（A/5）*B】/0.00001=50000A*BA—5个中方格中细胞总数B—菌悬液的稀释倍数中格结构图计数方法1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。　2、将细胞悬液吸出

6、少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。　3、静置3分钟。　4、镜下观察，计数板五个中格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：　　细胞数/ml＝50000A*B，A—5个中方格中细胞总数；B—菌悬液的稀释倍数注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。培养液换半量方法：瓶口消毒。从瓶侧面吸去原培养液量的一半。从瓶侧面补加等体积新培养液。翻转培养瓶，使培养液覆盖细胞面，瓶口消毒加塞。注意：培养液要事先预热至37度。六、结果与讨论日期培养液颜色变化细胞生长情况描述1．实验记录

7、表2．写出本次实验个人操作体会。注意写明实验中每一步是由谁参与操作的。