乳糖替代IPTG诱导重组尿酸酶表达条件优化.doc

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1、1.2.9乳糖替代IPTG诱导重组尿酸酶表达条件优化1.2.9.1乳糖溶液的配制称取20g乳糖溶解于一定量的ddH2O中，定容至100mL，无菌条件下用0.22μm膜过滤除菌，25℃下保存备用。1.2.9.2乳糖诱导最佳浓度确定以最佳接种量将种子液接入600mL发酵培养基中，无菌条件下均分到12个250mL锥形瓶中，于37℃，220rpm/min培养7h后向10瓶中分别加入不同浓度的乳糖溶液，使终浓度分别达到0.05、0.1、0.2、0.25、0.5、1、2.5、5、10、15、20g/L，诱导7h收获菌体；另一瓶培养到最佳诱导时机后加入IPTG达到最佳诱导浓度，诱导最佳时长后收获菌体，分别

2、测定菌体OD600并进行菌体全蛋白10~20%梯度SDS-PAGE分析表达量。1.2.9.3最佳诱导时机的确定以最佳接种量将种子液接入400mL发酵培养基中，无菌条件下均分4个500mL锥形瓶中，于37℃，220rpm/min培养，分别在培养开始、对数期初期、对数期中后期、对数期末期时加入200g/L乳糖溶液，使终浓度达到最佳诱导浓度，分别诱导7~8h，每隔1或2h取样测定OD600并进行菌体全蛋白10~20%梯度SDS-PAGE分析表达量。1.2.9.4乳糖诱导持续时间的确定以最佳接种量将种子液接入500mL发酵培养基中，无菌条件下均分到10个250mL锥形瓶中，于37℃，220rpm/m

3、in培养到最佳诱导时机后加入200g/L乳糖达到最佳诱导浓度，在最适温度和pH条件下持续诱导10h，每小时取出一瓶测定OD600并进行10~20%梯度SDS-PAGE分析表达量。1.2.9.5乳糖和IPTG诱导效果比较在摇瓶中培养工程菌(条件同前)，按照乳糖和IPTG各自最佳诱导条件进行诱导，收菌后超声破碎取上清测定蛋白含量和酶活力；将破碎沉淀、上清液和菌体同时进行10~20%梯度SDS-PAGE分析表达效果。破碎沉淀的处理：用一定量的pH6.850mmol/L磷酸缓冲液洗涤沉淀并重悬，加入等体积的2×SDS-PAGE还原型样品处理液使之溶解；上清液的处理：一定量的上清液加入等体积的2×SD

4、S-PAGE还原型样品处理液混匀；其余处理过程同1.2.5.6。1.1结果与讨论1.3.1发酵培养基的筛选结果通过分别用发酵培养基1、2、3进行工程菌的培养诱导后，将发酵培养液15000g离心10min后倒出培养液，用纸小心擦干离心桶内壁的残余水分，放在电子天枰上称沉淀湿重，并分别取0.4g湿菌体混悬于5mLpH8.50.1mol/LTris-HCl缓冲液超声破碎后取上清进行蛋白含量以及酶活力测定，结果如下：表1.4不同培养基所得细菌生物量和尿酸酶比活Table1.4Biomassofbacteriumandspecificactivitiesofuricasewithdifferentme

5、diums培养基湿重(g/瓶)蛋白含量(mg/mL)酶活力(U/mL)比活力(U/mg)发酵培养基10.1923.1662.919.9发酵培养基20.2153.1948.215.1发酵培养基30.2433.3060.418.3图1.2不同培养基中尿酸酶表达水平Fig1.2ExpressionlevelofuricaseindifferentmediumsLane1:Standardproteins;Lane2,4,6:Totalproteinsofbacteriainmedium1,3,2withoutinduceraddedin;Lane3,5,7:Totalproteinsofbacte

6、riainmedium1,3,2withinduceraddedin.菌体全蛋白电泳结果如图1.2：尿酸酶