免疫标记技术dun.ppt

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1、第四章免疫标记技术免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应；并藉助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。1941年Coons建立荧光

2、抗体技术（fluorescentantibodytechnique），使组织和细胞中抗原物质的定位成为可能。1956年Yalow和Berson建立放射免疫测定（radioimmunoassay，RIA），普遍应用于体液中的激素、微量蛋白及药物的测定。1966年Nakene和Pierce利用酶使底物显色的作用而得到与荧光抗体技术相似的结果。酶用作免疫技术标记物是从抗原定位开始的。上个世纪70年代初，酶标抗体技术开始应用于免疫测定，其后得到迅速发展。第四章免疫标记技术第一节荧光免疫技术第二节酶免疫技术第三节放射性免疫第四节免疫胶

3、体金技术第一节荧光免疫技术1.1有关荧光的基本知识1.2荧光抗体技术1.3荧光免疫测定1941年，Coons等首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。1.1有关荧光的基本知识一、荧光现象（一）荧光的产生一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停

4、止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。（二）荧光效率荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。荧光效率＝发射荧光的光量子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。（三）荧光的猝灭荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会

5、减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。二、荧光物质（一）荧光色素许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明等。（1）异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanat

6、e，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490~495nm，最大发射光波长520~530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。FITC其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。（2）四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm

7、，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。（3）四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethyl-rhodamineisothiocyanate，TRITC）最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。（二）其他荧光物质（1）酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例①，4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发

8、出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。例②，碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。（2）镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）、铈（Ce3+）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光。Eu3+应用最广。Eu3+螯合物的