免疫组织化学.ppt

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1、免疫组织化学报告人：傅琦博指导老师：胡翊群傅琦博F0318102何谓免疫组化免疫组织化学是指在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织呈色反应，借助可见的标记物，对相应的抗原或抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法。傅琦博F0318102免疫组化的全过程抗原的提取与纯化免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体及纯化标记物与抗体集合形成标记抗体标本的处理抗原抗体反应和呈色反应显微镜下观察结果傅琦博F0318102组织抗原抗体标记物标记抗体1荧光2酶3亲和技术4金标傅琦博F0318102组织抗原免疫细胞化学反应原理：＋标记抗体标记的抗原抗体复合物傅琦博F0318102间接法直接

2、法两种免疫细胞化学反应方法傅琦博F0318102标本的处理标本的主要来源：活体组织、各种体液、穿刺液、培养细胞标本的固定与保存酶消化处理组织材料处理是获得良好免疫细胞组织化学分析的保障，必须保证要检测的细胞或组织取材新鲜、固定即使及时、形态保存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。傅琦博F0318102标本的固定与保存固定的目的：是细胞内蛋白质凝固，终止胞内酶活化反应，防止细胞自溶，保持细胞固有形态与结构，防止细胞脱落，去除干扰抗原抗体反应的类脂，最主要的是保存组织细胞的抗原性，在染色和反复清洗的过程中使抗原不致释放。好的固定剂：（1）能快速固定抗原（2）防止抗原物质扩散（3

3、）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应傅琦博F0318102标本的固定与保存抗原固定剂固定温度与时间蛋白质95％乙醇室温，3～15min免疫球蛋白丙酮4℃，30min酶四氯化磺4℃，30min激素1％聚甲醛4℃，4～5h细菌丙酮、甲醇室温，3～10min病毒丙酮，无水乙醇室温，5～10min四氯化磺4℃，30～60min类脂质10％甲醛室温，3～10min细胞悬液1％聚甲醛室温，2min各种抗原的固定傅琦博F0318102标本的固定与保存冰冻切片和石蜡切片时免疫组化中最常用的制片方法。冰冻切片制片方法简单，可避免石蜡切片因固定、脱水、浸蜡等步骤造成的抗原损失。迅

4、速冷冻可防止冰晶的形成，避免组织细胞结构的破坏。石蜡切片是观察组织细胞结构的理想方法，可用于陈旧石蜡包埋材料的回顾性免疫组化研究，切片薄，有连续性，蜡块可长期保存，但是抗原的保存量不如冰冻切片。傅琦博F0318102酶消化处理石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固定过程中由于醛键形成致使某些抗原决定簇被封闭，染色不理想，甚至出现假阴性，因而在进行免疫组化反应之前，需要酶消化处理切片，可使抗原决定簇重新裸露。常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。傅琦博F0318102抗体处理与保存抗体是免疫组化技术的首要试剂，通常选用的高特异性、高效价的第一抗体为多克隆抗体。抗体稀释

5、的原则是阳性（抗原）物质着色应鲜明，背景应钱或不着色。抗体效价越高，孵育时间越长，方法越敏感抗体稀释度应越高。傅琦博F0318102免疫染色标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体复合物；用缓冲液冲洗去未结合的成分；直接在显微镜下观察结果（免疫荧光直接法），或待标本显色后再用显微镜观察结果（免疫酶直接法）免疫染色是免疫组化技术的关键步骤。傅琦博F0318102免疫染色对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加检测的敏感性和特异性，减少非特异性干扰。1.蛋白酶消化法采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以利于抗体与抗原最大限度的结合。常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋

6、白酶、链霉蛋白酶等。2.非特异吸附法免疫组化技术中非抗原抗体反应出现的阳性染色成为非特异性染色。防止非特异性染色的有效方法是采用与第二抗体相同的动物源血清（非免疫血清）吸附封闭底物煮至上的带电荷物质，然后再进行抗原抗体结合反应，必要时也可采用2%左右的牛或人白蛋白封片，减少非特异性染色。傅琦博F0318102免疫组化染色中标识物的选择用量微小，容易在光镜或电镜下识别机体内无同一物质或类似物质物理或化学性质稳定，可与抗原或抗体结合，其结合物也稳定目前常用标识物质有荧光色素、放射性同位素、重金属、微粒子、酶等傅琦博F0318102设立对照实验为确定结果的可靠性，在实验中必须

7、设置对照。通常是针对第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对照、替代对照、空白对照、自身对照和吸收试验等。（1）阳性对照用一直抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。（2）阴性对照用不含一直抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑制对照等，用以排除假阳性结果。傅琦博F0318102免疫组化的结果判断染色特异性染色非特异性染色显色部位特定细胞或间质细胞和间质均匀染色或更强显色定位特定，具有结构性无特定部位，无结构性显色程度同一部位呈不同程度显色无