2015 新版 免疫组织化学技术ppt课件.ppt

《2015 新版 免疫组织化学技术ppt课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第七章、免疫组织化学技术Immunohistochemistry吉林大学白求恩医学院组织胚胎学系李树蕾2015-6免疫组织化学或免疫细胞化学概念：利用抗原与抗体间特异性结合的原理，对组织切片或细胞标本中的某些多肽和蛋白质等大分子物质进行原位定性、定位或定量研究的实验技术。免疫组织化学的特点特异性强、敏感性高、形态与功能相结合定位精确度可达超微结构水平所有抗原或半抗原的物质均可应用抗体进行检测第一节免疫组织化学技术概述一、免疫组织化学技术的基本原理（一）抗原-抗体反应特异性结合是免疫组化技术的基础1.抗原能刺激机体免疫系统发生免疫应答，并且能与

2、免疫应答产生的效应物质（抗体/致敏淋巴细胞）在体内外发生特异性结合的物质免疫原性：抗原分子具有诱导机体产生免疫应答，刺激机体产生抗体/致敏淋巴细胞的特性，由抗原决定簇决定。反应原性：抗原分子能与抗体/致敏淋巴细胞发生特异性结合的特性。完全抗原：具有两种能力，蛋白质、多肽、病原微生物半抗原：与大分子载体结合后获得免疫原性，多糖、类脂2.抗体（免疫球蛋白）（1）抗体的分子结构和性质IgG、IgA、IgM、IgD、IgE木瓜蛋白酶水解得到2个Fab段和1个Fc段胃蛋白酶水解得到1个F（ab’）2和1个Fc段Fab和F（ab’）2均保持抗体活性Fc段

3、具有免疫球蛋白的表位和免疫原性（2）抗体的种类1）制备途径多克隆抗体特点含许多针对同一抗原不同表位的抗体与抗原亲和力强特异性较差，非特异性反应（结合非目的抗原表位）制备需要大量抗原，抗原纯度要求高单克隆抗体特点由一个杂交瘤细胞系产生，分子结构一致，只识别抗原分子表面的单一表位特异性强与抗原亲和力弱多克隆抗体兔多抗价格低，效价高非特异性反应高，效价不稳定单克隆抗体小鼠单抗大鼠单抗兔单抗特异性强，无交叉反应，效价稳定价格高，效价低浓缩型抗体摸索效价市售抗体稀释液，或含1-3%非免疫血清PBS即用型抗体无需摸索效价基因工程抗体采用基因重组技术及蛋白

4、质工程技术，在基因及蛋白质水平直接切割、拼接或修饰组装的抗体，特点特异性更强稳定性更好可批量大规模生产2）抗体的来源兔抗体、小鼠抗体、大鼠抗体、羊抗体、驴抗体等3）在免疫组化中的应用顺序第一抗体：首先应用，能够识别待测抗原的抗体第二抗体：能与特异性第一抗体结合的抗体。是用于第一抗体同种属的动物血清免疫另一种属动物获得的抗体。第三抗体：为了提高敏感性，第二抗体不标记，第三抗体标记。抗原第一抗体（小鼠抗体）第二抗体（兔抗小鼠）识别第一抗体的Fc段可被多种标记物标记（3）抗体的选择、稀释与保存抗体获得途径：公司购买；自己制备抗体类型：冻干粉；原液/

5、浓缩型抗体；即用型抗体抗体保存：分装，蜡膜封口，-80℃或-20℃冰箱保存（加入等量甘油）数年，避免反复冻融；4℃保存数周。抗体稀释：涡旋混匀，4℃保存1周。抗体浓度：根据商家推荐稀释度进行等比稀释，摸索最适浓度一抗稀释度特异性染色强度非特异性染色背景强度1:50十十十十十十1:100十十十十1:200十十一阴性对照一一在一抗稀释度1:100和1:200之间可找出最佳稀释度。（二）免疫标记反应用于标记抗体的标记物能与抗体形成比较牢固的共价结合不影响抗原与抗体的结合放大效率高发光或显色反应要在抗原-抗体结合的原位并且鲜明，有良好的对比度常用标记

6、物：荧光素、酶、亲和物质、金属颗粒、放射性核素（三）呈色反应利用传统的组织化学技术，使在组织或细胞内形成的免疫反应复合物中的抗体上的标记物又与其他物质反应，形成可见的有色沉淀，或者通过标记物发出荧光，最后用普通显微镜、电子显微镜或荧光显微镜观察产物或荧光，从而对抗原进行定性、定位或定量。二、免疫组织化学技术特点特异性强抗体的高度特异性识别能力，得到单个氨基酸水平敏感性高最大限度保存了组织或细胞内待测抗原；高敏感、高亲和力抗体；多步放大；先进检测设备形态、功能和代谢密切结合传统形态学定位传统免疫学定性传统生物化学定量三、免疫组织化学技术分类1.

7、根据标记物的不同分类免疫荧光组织化学荧光素标记抗体，荧光显微镜免疫酶亲和组织化学酶标记抗体，催化底物形成有色沉淀，显微镜观察亲和免疫组织化学利用某些物质之间的高亲和力，在免疫组化方法中建立有效的抗原放大系统免疫金组织化学金颗粒（粉红色/高电子密度）标记抗体，显微镜/电镜2.根据标记物是否与特异性第一抗体结合分类（1）直接法标记物标记的特异性抗体直接与标本中的相应抗原结合，再与酶的底物作用产生有色产物沉积，或观察荧光，在抗原抗体反应的部位即可检测。特点：操作简单特异性强，非特异性反应低敏感性低抗原量少时无法检测市售标记一抗少（2）间接法第一抗体

8、（兔）不标记，使用与一抗种属相同抗体的Fc段（有种属特异性）作为抗原免疫动物（羊），制备第二抗体（羊抗兔），并标记第二抗体。染色时，顺次以第一抗体和标记的第二抗体处